乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种带有包膜的DNA病毒，有嗜肝性，可以造成人类持续性病毒感染(persistent viral infection)。慢性HBV感染(chronic HBV infection)是世界范围内最为严重的公共卫生问题之一，是导致肝硬化和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要原因。尽管目前已有预防性疫苗可有效预防新发HBV感染，但在全世界范围内仍有约2.48亿慢性HBV感染者，且难以被现有治疗手段治愈^{[ 1]}。慢性乙肝感染者罹患肝癌的风险较无HBV携带者高5–100倍^{[ 2- 3]}。虽然目前治疗慢性HBV的药物(如核苷类似物、干扰素等)可以减少癌症的发展^{[ 4]}，但在治疗的前五年，发展成为肝癌的风险仍然高于正常水平^{[ 5- 6]}，特别是晚期肝病患者。慢性乙肝感染的最佳临床治疗终点是使患者达到HBsAg血清学阴转或血清学转换，达到这一终点的患者发展为重症肝炎(肝衰竭)、肝硬化和肝癌等终末期肝病的风险大大降低，因此可被视为实现慢性乙肝的“临床治愈”。然而，现有基于干扰素类和核苷/核苷酸类似物及其组合的临床治疗策略虽能控制病毒复制，缓解疾病进展，但并不能有效实现临床治愈(通常 < 5%)。因此，发展更为有效治疗药物以实现慢性乙肝患者的有效临床治愈，是全球乙肝防治科技工作者在未来5–20年内面临的现实挑战。

支持HBV感染和复制的体外细胞模型，是研究HBV生活史的重要工具，并在治疗新靶点发现和候选药物功效评估等研究工作中发挥关键作用。近年来，HepaRG、HepG2-NTCP、干细胞分化来源的类肝细胞等在HBV相关研究中广泛应用于病毒宿主相互作用^{[ 7- 8]}、HBV感染复制相关宿主因子的发现鉴定^{[ 8- 9]}、针对HBV生活周期关键节点的靶向药物筛选^{[ 10- 13]}等。本文对支持HBV相关体外细胞模型的新近研究进展进行总结归纳，并详细分析这些模型在HBV研究中的应用现状和局限性，以进一步探讨构建更为完善的HBV细胞模型。

1 HBV体外感染模型

HBV的感染过程主要包括：病毒颗粒与细胞的结合、脱外膜蛋白释放核衣壳入胞、rcDNA在核内形成cccDNA、5种形式RNA的转录、前基因组RNA (pgRNA)作为模板逆转录并最终形成rcDNA回补cccDNA池、HBV相关蛋白的翻译与成熟、病毒颗粒的组装与释放等( 图 1)。

1.1 原代肝细胞

人类的肝细胞是HBV的特异性宿主。在相当长一段时间里，人类原代肝细胞(PHH)是唯一支持HBV体外感染的研究模型^{[ 14]}。但是，人原代肝细胞来源有限，体外培养技术要求较高且不能连续扩增，极大地限制了其在HBV研究中的应用^{[ 15]}。一般而言，在体外培养条件下，PHH的肝细胞表型会在铺板培养的数天内快速改变，进而导致其支持HBV感染的能力降低^{[ 14]}。此外，HBV对于人原代肝细胞的感染有一定的宿主遗传背景依赖性，不同供体之间的高度异质性也影响了基于PHH细胞的HBV感染研究结果的可重复性^{[ 16]}。针对PHH体外培养表型维持难的问题，Bhatia等新近构建了一种称为微型共培养系统(micro-patterned co-cultured，MPCC)的培养体系，该系统是将200–400个PHH在精确的微尺度结构中与3T3小鼠胚胎成纤维细胞共培养至少9 d，使得原代肝细胞恢复其极性并形成胆管网络，在该培养体系中的PHH可保持数周正常的存活力和代谢功能^{[ 17]}。有研究表明MPCCs可支持HBV的感染^{[ 18]}。考虑到人肝脏结构的复杂性以及体外培养条件下细胞之间的相对位置和相互作用，相比2D模式的培养，3D模式的培养体系或许更接近真实情况下的HBV感染^{[ 19]}。除PHH外，树鼩(Tupaia belangeri)的原代肝细胞(PTH)也可以支持HBV的感染^{[ 20]}。2013年，北京生命科学研究所李文辉教授团队的Yan等利用树鼩的原代肝细胞模型发现鉴定出人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是HepG2等常用肝癌细胞株中缺少的HBV感染所需的功能性受体^{[ 9]}。PTH模型也可被用于研究NA类药物抗HBV反应的作用机制^{[ 21]}以及从病人血清中分离出来的不同HBV毒株的功能表型^{[ 22]}。与PHH类似，PTH也存在来源限制和体外培养表型改变的问题，但是原代肝细胞依旧是研究HBV感染中在生理上最接近自然状态的易感细胞，它具有HBV天然宿主的典型特征和正常的胞内天然免疫应答^{[ 23- 24]}，是研究病毒宿主相互作用、评估药物抗HBV作用最为可靠的模型( 表 1)。

1.2 HepaRG细胞

HepaRG细胞是从一位慢性丙型肝炎病毒感染的女性肝癌患者的肝脏肿瘤中分离出来的具有分化潜能的肝祖细胞系^{[ 25]}。相比于其他肝癌来源的细胞系，HepaRG细胞保持了大量的生理性肝功能，并表现出与原代肝细胞更接近的基因表达模式。经过2周的2% DMSO诱导分化后，HepaRG细胞可以分化为类肝细胞和类胆管细胞(各约50%)，其中类肝细胞可支持HBV的感染^{[ 25]}。相比于原代肝细胞，HepaRG可多次传代，分化后的HepaRG细胞还能进行逆分化重新回复到肝祖细胞阶段进行扩增，感染重现性也显著提高。有鉴于此，HepaRG/HBV系统可以用来筛选抑制HBV感染的小分子，如ezitimibe^{[ 26]}。研究证实，分化后的HepaRG细胞能支持完成HBV完整生命周期，并支持cccDNA的合成和持续^{[ 27]}。由于分化后的HepaRG细胞具备较为完善的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶活力，这一细胞也被广泛运用于药物代谢相关研究。除在体外HBV感染中的运用，我们实验室近期发表的研究表明，通过多种小分子组合优化的诱导程序分化出的HepaRG类肝细胞可在FRGS小鼠中实现一定程度的人源化重建，并支持体内HBV感染^{[ 28]}。

Schulze等利用HepaRG细胞阐明了在HBV感染细胞起始步骤中硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPGs)的重要性^{[ 29]}。Sureau和Salisse等用HepaRG细胞找到了位于HBV膜蛋白抗原环区的硫酸乙酰肝素结合位点，该位点对于HBV的感染起着至关重要的作用^{[ 30]}。Ni等通过比较已分化的和原始HepaRG细胞的转录组模式，证实了NTCP作为细胞受体在HBV感染过程中的重要作用^{[ 31]}。Macovei等基于HepaRG细胞的研究发现小窝蛋白-1 (caveolin-1)在HBV病毒粒子内吞过程中的作用^{[ 32]}。此外，大量研究发现HBV的感染可在一定程度上促发HepaRG细胞Ⅰ型干扰素应答^{[ 33]}，提示这一细胞可用于HBV感染相关天然免疫识别和应答的宿主因子研究。尽管基于HepaRG细胞的HBV感染模型具有诸多优点，但也存在一些不足：如感染需要一个较长的培养和分化周期(大约4周)、实际感染效率较低且需较高的感染剂量(> 1000 GE/cell)、很少的甚至几乎没有cccDNA的扩增^{[ 27]}等，这些因素都极大地限制了HepaRG在高通量大规模抗HBV药物筛选中的应用( 表 1)。

1.3 外源表达NTCP的肝癌细胞系

NTCP是多次跨膜的胆汁酸转运蛋白，特异性地在肝细胞膜表面表达，能与HBV病毒外膜蛋白pre-S1区域特异性结合^{[ 6]}，是常用肝癌细胞系(如Huh7、HepG2等)中表达缺失的HBV功能性受体^{[ 9]}，由于缺乏内源性NTCP表达，HepG2等广泛运用于生物医学实验室研究的传代细胞系，在正常培养条件下不能支持HBV感染，但在其中外源性表达NTCP可恢复其HBV易感性^{[ 9, 31]}。由于肝癌细胞易培养、增殖快的特点，外源表达NTCP的肝癌细胞系为HBV的体外感染研究相对高效的细胞模型。值得注意的是，同样外源表达hNTCP的HepG2细胞(HepG2-NTCP)比Huh7 (Huh7-NTCP)的感染效率更高，可能提示两种细胞在cccDNA形成能力或者其他影响HBV感染的基因表达水平等方面存在差异^{[ 9, 34]}。有研究表明HepG2-NTCP细胞对细胞培养来源的HBV病毒(cell culture derived HBV，ccHBV)易感性要显著高于慢性HBV感染者血清来源的HBV病毒(patient’s serum derived HBV，sHBV)，这与HepaRG细胞上的感染表现相反。此外，ccHBV在HepG2-NTCP细胞中的感染常表现为HBeAg/HBsAg分泌水平比例较高，这与病毒在生理条件和HepaRG、PHH感染模型中的感染特征也有区别^{[ 35]}。Qiao等和Ni等发现使用2%以上的DMSO处理HepG2-NTCP细胞能提高其对细胞来源HBV的易感性，显著提升感染后HBeAg的分泌水平和胞内HBV复制水平^{[ 31, 36]}，但是也有研究发现，使用DMSO处理细胞并不能提高感染后HepG2-NTCP细胞的HBsAg分泌水平，也不能显著改善其对病人血清来源的HBV的易感性^{[ 35]}。

尽管NTCP是HBV感染的重要受体，但外源表达hNTCP的鼠肝细胞并不能支持HBV的有效感染^{[ 37- 39]} ( 表 1)。Lempp等发现存在于病毒入胞后和以cccDNA为模板进行转录的步骤之间的某些宿主依赖性因子的缺乏是外源表达hNTCP的鼠肝细胞不能有效支持HBV感染的关键因素^{[ 40]}。近期有研究发现，外源表达hNTCP的鼠肝细胞系AML12能一定程度地支持体外HBV感染，该细胞来源于过表达人转化生长因子α(hTGFα)的转基因小鼠^{[ 41- 42]}，进一步研究AML12和其他鼠肝细胞/细胞系中存在的影响HBV感染的关键差异，或有助于发现除NTCP外决定HBV宿主特异性的重要分子，如获突破则可能发展出支持HBV感染的小动物模型，进而为乙肝相关研究提供便捷高效的体内模型。

虽然尚有不足，以HepG2-NTCP为代表的外源表达NTCP的肝癌细胞系因其易操作、短周期、重现性佳的优势为HBV研究提供了强大而便捷的工具( 表 1)。Chunkyu等利用HepG2-NTCP细胞发现DEAD盒RNA解旋酶家族成员DDX3是HBV宿主限制因子，可阻碍cccDNA的转录^{[ 43]}。Verrier等利用Huh7-NTCP细胞发现GPC5作为肝细胞表面的附着因子在HBV感染入胞过程中起着重要作用^{[ 44]}。有研究基于这一模型发现，一些分子可以通过与NTCP的直接相互作用，如环孢菌素A^{[ 45]}及其衍生物^{[ 46]}，或者通过下调NTCP的表达，如白介素6 (interleukin 6，IL6)^{[ 47]}，来抑制HBV的入胞。外源表达NTCP的肝癌细胞系也为筛选靶向入胞过程的抗病毒药物提供了支持，如雷帕霉素及其衍生物^{[ 48]}、vanitaracin A^{[ 49]}、环孢菌素A及厄贝沙坦^{[ 50]}等均已在这一系统中证实了其对HBV的感染抑制活性。Nishitsuji等将改造后的3种HBV质粒共转肝癌细胞，培养上清经纯化获得具有感染能力并携带NanoLuc报告基因的重组HBV病毒，感染HepG2-NTCP细胞后通过NanoLuc的表达测定来评价HBV病毒从入胞到DNA转录的早期生命周期的活性，该系统将为大规模筛选针对HBV生命周期早期阶段的抗病毒药物提供工具^{[ 10, 51- 52]}。

1.4 干细胞定向分化或非肝细胞转分化来源的类人肝细胞

2006年，日本科学家山中伸弥(Yamanaka)通过外源导入Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc可将终末分化的皮肤成纤维细胞逆分化成多能干细胞，即诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)^{[ 53]}。进一步的研究表明，通过人胚胎干细胞或诱导多能干细胞的分化可以获得功能性的类人肝细胞(human hepatocyte-like cells，HLCs)。已有多项研究表明，iPSC来源的HLCs能支持体外HBV感染^{[ 54]}。近期，我们实验室的研究也表明，iPSC来源的HLCs能在FRGS小鼠中实现肝重建并支持HBV的体内感染^{[ 55]}。除干细胞定向分化来源的类人肝细胞(stem cell-derived hepatocyte-like cells)外，我国惠利健教授研究团队建立了可绕开干细胞阶段，直接将成纤维细胞分化成类人肝细胞的技术体系，他们的研究发现将FOA3、HNF1A、HNF4A三个转录因子转入人胚胎成纤维细胞可以将其转分化为类人肝细胞(human induced hepatocytes，hiHep)^{[ 56]}。研究证实，hiHep细胞具有与PHH类似的基因表达谱和代谢功能。本实验室新近的一些研究数据(未发表)也表明，hiHep细胞能在体外支持HBV的感染和复制。总体上，干细胞定向分化或非肝细胞转分化来源的类人肝细胞为HBV的体外感染复制模型提供了新的细胞来源，这类细胞在某些方面相比于基于肿瘤细胞的HBV模型更为接近真实生理状态，但也存在操作周期长、感染效率低等不足，其在HBV研究领域广泛应用可能需要进一步完善优化( 表 1)。

2 HBV体外复制模型

与感染模型不同的是，在HBV复制模型中缺少NTCP等HBV相关受体的表达，五种形式HBV RNA的转录最初来源于整合于宿主细胞染色体或者其他载体上的HBV基因组( 图 2)。

由于HBV的感染和复制具有肝细胞嗜性，所以常用于研究HBV复制的细胞模型均基于肝癌细胞系。Huh7和HepG2细胞系在体外培养方便且易生长，尽管缺乏NTCP，但可高效支持HBV的转录、复制和病毒产生^{[ 57- 58]}。

2.1 稳定整合HBV基因组的细胞系

1987年，Sells团队和Chang团队分别将二倍体的HBV基因组转入不同肝癌细胞实现了病毒的复制、病毒基因的表达以及感染性病毒颗粒的形成^{[ 57- 58]}，但病毒不能持续存在。HepG2.2.15细胞是在HepG2细胞中整合了双拷贝HBV基因组的稳定细胞株，能够稳定表达病毒基因相关产物并保证持续的HBV复制能力( 表 2)，已被广泛用于HBV基础生物学问题的研究，同时为早期抗病毒药物的发展提供了工具^{[ 59- 60]}，Dandri等通过对HepG2.2.15细胞进行活性氧或DNA修复抑制剂处理，发现DNA损伤可以增加HBV整合的频率^{[ 61]}。1997年，Lander等^{[ 62]}利用四环素控制型CMV启动子构建了HBV 1.1倍基因组表达载体，转入HepG2细胞使其成为稳定整合HBV的HepAD38细胞株( 表 2)。在HepAD38细胞中，HBV pregenomic RNA的转录和病毒基因组复制可由四环素控制。与HepG2.2.15细胞系相比，HepAD38细胞系表达可调控，在Tet-off情况下HBV病毒的产量和胞内cccDNA的积累显著高于HepG2.2.15^{[ 63]}。利用该细胞系，Cui等发现TDP2 (tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 2)的缺失并不能阻断cccDNA的形成，该发现提示TDP2对于cccDNA的形成或许并不是必需的^{[ 64]}。HepDE19细胞( 表 2)也是一种在Tet调控下表达HBV的稳转细胞系，该细胞系是将1.1倍体的HBV基因组转入细胞中，特殊的是整合的基因片段5′端pre-core的ATG突变成了GTG，而3′端pre-core的ATG保持完整，这种条件下HBV的E抗原(HBeAg)表达和分泌只能来源于共价闭合环状DNA (cccDNA)，HBeAg的水平与胞内cccDNA水平是呈正相关的，从而为cccDNA靶向药物的高通量筛选提供了一个很好的模型^{[ 65- 66]}。在免疫检测中，由于HBeAg与HBcAg有154个氨基酸的同源性，多数用于HBeAg检测的抗体均与HBcAg存在一定程度的交叉反应，再加上naked HBV capsid的大量存在，使得在此种条件下采用商品化的HBeAg试剂检测到的可能不是真正意义上的HBeAg，可能无法准确反映胞内cccDNA的真实水平。为解决这一问题，Cai等^{[ 67]}将HA标签(influenza hemagglutinin，HA)插入到HBeAg的precore区，在四环素调控下进行HBV的相关表达，以HA抗体为捕获抗体、HBeAb为检测抗体，获得了不影响HBV复制且无背景反应的cccDNA报告系统(HepBHAe82)( 表 2)。

2.2 HBV基因组的传递载体系统

由于HepG2和Huh7两种细胞的转染效率并非十分理想，研究者探索了基于病毒载体的高效递送系统以实现不同HBV毒株在肝细胞中的高效复制。1998年，Delaney等在昆虫细胞中构建制备了携带HBV复制子的重组杆状病毒，这种杆状病毒可以将具有功能性的HBV基因组导入肝癌细胞HepG2中，进而进行HBV的复制表达、感染性病毒颗粒的形成以及细胞内可检测到的cccDNA池的形成，且HBV病毒的表达水平与所感染的病毒量呈正相关^{[ 68- 70]}( 表 3)。该系统被广泛用于体外研究实验，如NA耐药突变型HBV的功能表型研究^{[ 71]}以及新型抗HBV药物药效研究^{[ 72]}。腺病毒载体也被应用到HBV复制子的递送中^{[ 73]}，Sprinzl等以腺病毒为载体将HBV 1.3倍基因组导入293细胞中制备重组腺病毒以感染HepG2细胞，不仅检测到高效的HBV复制表达，还能通过腺病毒载体上的绿色荧光蛋白报告基因表达情况来判断基因转导效率。研究表明，使用携带HBV复制子的腺病毒载体感染不同种属的肝细胞，可实现HBV在不同种属肝细胞中的复制^{[ 74- 75]}( 表 3)。另外，以慢病毒作为载体的系统也被应用于体外研究^{[ 76]}。有研究表明，使用含有HBV复制能力的重组杆状病毒和腺病毒衍生载体可促进体外更多的cccDNA量的形成^{[ 69, 75]}。尽管如此，基于病毒载体的HBV复制子传递系统也存在一些限制：第一，通过病毒载体的方式将HBV基因组转入细胞完全跳过了天然情况下HBV感染的入胞阶段，因此该系统不能用于HBV生活史中重要入胞阶段的研究；第二，部分对HBV感染的宿主胞内免疫应答可能会被对用于HBV传递的病毒载体的非特异性反应所掩盖^{[ 33]}；第三，潜在的生物安全风险是限制该系统被广泛应用的主要因素。

3 讨论和展望

支持HBV感染和复制的细胞模型是HBV研究的重要工具，其快速发展推动了我们对HBV生命周期的深入认识，也加速抗HBV新药研究的进展。支持完整HBV生命周期的细胞模型使得我们能够对HBV感染和复制的各个关键环节进行针对性的干预策略设计：如针对病毒粘附与入胞、核衣壳解聚、HBV DNA的转录、RNA逆转录、RNA的稳定、衣壳的组装、病毒的分泌等。然而，现有的细胞模型并非完美，研究者还需针对下述目标努力：(1)细胞的生理状态和指标更接近正常的肝细胞；(2)来源不受限制且容易获得；(3)更加便宜且方便培养；(4)更加高效的感染以实现HBV的感染传代等。

构建可实现可视化示踪的HBV病毒感染报告系统和可量化指示胞内cccDNA水平的便捷模型对于新型抗HBV药物的高通量大规模筛选有重要意义。一方面，实现HBV感染的可视化检测有助于结合超高分辨显微成像技术和组学技术在单细胞水平研究HBV感染和致病的分子机制。另外一方面，HBV cccDNA的清除是慢性乙肝治疗的终极目标。开发针对HBV cccDNA的药物是治愈乙肝的有效策略之一。由于HBV cccDNA的形成及维持机制尚不清楚，直接的靶向药物设计缺乏清晰的理论指导，高通量化合物库的筛选成为靶向cccDNA药物开发的最优选择。然而，目前没有简便可靠的可供高通量药物筛选使用的HBV cccDNA检测方法，此类模型的研究或将成为HBV细胞模型研究的重要方向。