靶向治疗是NSCLC的重要治疗方式，基因检测则是靶向治疗的基础。对NSCLC患者样本进行基因检测可以识别其驱动因素，指导靶向药选择，以收获最佳治疗效果。目前NSCLC患者检测出的驱动因素包括EGFR突变、ALK突变、MET外显子14跳跃突变等，其中罕见突变MET外显子14跳跃已被指南列为NSCLC的必检基因，临床上主要通过基于DNA或RNA的二代测序技术对其进行检测，丰富了该类罕见突变患者群体的用药选择，增加了临床获益。
剪接体错误剪接导致MET外显子14跳跃突变
MET外显子14跳跃突变是非小细胞肺癌的独立驱动因素，在中国NSCLC人群中的发生率约为0.5-0.9%[1,2]，意味着中国每年约有6000人左右的新发病例为MET外显子14跳跃突变阳性。该突变发生时，MET基因将转录得到外显子14缺失的mRNA，翻译后会产生截短的MET受体，该截短型MET受体不易被泛素化降解，增加了MET的存续时间，引起下游信号的持续激活，驱动了肺癌的发生和发展[3]。
引起外显子14跳跃突变的原因多种多样，包括外显子14上下游的内含子碱基对插入、缺失以及外显子14的碱基替换等，目前检测出的分子多样性已超过160种[4]。这些突变通过影响剪接体（Spliceosome）对前mRNA（pre mRNA）的识别，从而使剪接体错误的将外显子14剪切掉，导致了MET外显子14跳跃突变的发生[5]。
可通过RT-PCR和NGS技术检测MET 14号外显子跳跃突变
在2021版《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》中，MET 14号外显子跳跃突变已被列为四大必检基因之一 [6]。MET外显子14跳跃突变的异常可体现在DNA、RNA以及蛋白等多个层面，因此针对该基因突变的检测方法也是多种多样的，比如免疫组化学染色可检测突变蛋白，二代测序（NGS）可检测突变的DNA及RNA。
基于准确性和快速检测的考量，目前临床上主要通过NGS和RT-PCR方法来检测MET外显子14跳跃突变，在组织或细胞学样本不可及时，通过NGS检测循环肿瘤DNA（ctDNA）也可作为补充[7]。
逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）是指是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的检测技术，可检测MET外显子14跳跃突变的mRNA含量。
检测原理是首先提取患者组织或细胞样本中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，加入可针对MET基因mRNA的引物，在逆转录酶作用下将目标mRNA转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，得到大量的MET cDNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳来检测是否有MET外显子14跳跃突变的cDNA，以此判断MET的突变情况[8]。
二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）允许短时间内同时检测大量核苷酸，有着低成本、高准确度、高通量和快速检测的优点，已成为目前最常用的基因检测手段之一。
NGS可用来检测MET外显子14跳跃突变的mRNA或DNA含量，检测原理是首先提取患者样本中的DNA或RNA并将它们片段化，之后将小片段加上特定接头（片段化的RNA需要先逆转录为cDNA再加接头）。连上接头以后，片段化的DNA或cDNA和flowcell的表面接头连接后被固定，并与引物结合形成桥状结构，加入未标记的dNTP后形成双链桥状结构，之后便利用荧光标记的dNTP进行扩增，每引入一个荧光标记的dNTP都能释放出对应的荧光信号，测序仪捕获荧光信号后即可通过计算机软件将光信号转换为测序峰，从而获得待测片段的序列信息[9]，以此来判定是否发生MET外显子14跳跃突变。
RNA-NGS较DNA-NGS更具优势，为临床检测首选
根据协和医学院的研究，以RT-PCR为标准参照，RNA-NGS的检出率和准确度都要优于DNA-NGS技术[10]。对77例肺肉瘤样癌患者的测序结果显示，共有16例患者为MET外显子14跳跃突变阳性，RNA-NGS技术可将阳性患者全部检出，而DNA-NGS技术只检出了13例，漏检率为18%，漏检的原因是这3位患者的碱基突变类型此前未有报导，故未被识别。
总的来说，检测mRNA的准确率和检出率会比检测DNA要高，DNA上的碱基突变可能有数百种，商业化的引物并不能覆盖到所有的突变形式，因此可能导致假阴性的检测结果。而mRNA只有13和15号外显子融合这一种形式，如果没有发生降解是一定能够检测出来的。RT-PCR检测速度快，准确度高，但对RNA片段质量要求高，临床应用缺乏质量控制标准，尚未获得相关指南推荐。相比RT-PCR，NGS技术在灵敏度、检测通量和标准化上更具优势，可同时检出多个突变基因，目前临床实践针对MET 14号外显子跳跃突变的检测中，首选RNA- NGS[11]，或是RNA- NGS和DNA-NGS相结合，以帮助患者更好的识别其驱动基因。
下篇推文将对MET外显子14跳跃突变的治疗进行讲解，敬请期待。
参考文献
[1] Si X, Pan R, Ma S et al. Genomic characteristics of driver genes in Chinese patients with non-small cell lung cancer. Thorac Cancer. 2021 Feb;12(3):357-363.
[2] Liu SY, Gou LY, Li AN et al. The unique characteristics of MET exon 14 mutation in Chinese patients with NSCLC. J Thorac Oncol. 2016;11(9):1503–1510.
[3] 尹利梅,卢铀.MET 14外显子跳跃突变在非小细胞肺癌中的研究进展[J].中国肺癌杂志.2018;7(21)553-559.
[4] Cortot AB, Kherrouche Z, Descarpentries C et al. Exon 14 Deleted MET Receptor as a New Biomarker and Target in Cancers. J Natl Cancer Inst. 2017 May 1;109(5).
[5] Fujino T, Suda K, Mitsudomi T. Lung Cancer with MET exon 14 Skipping Mutation: Genetic Feature, Current Treatments, and Future Challenges. Lung Cancer (Auckl). 2021 May 20;12:35-50.
[6]《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》2021版
[7] 2022版CSCO肺癌诊疗指南更新，提升了MET 14号外显子跳跃突变检测级别！
[8] 范志勤,吴振华,王兴名,等. 血清中CD44v5及c-met检测对食管鳞癌高危人群的筛检价值[J]. 现代肿瘤医学,2017,25(14):2250-2255.
[9] https://www.illumina.com/
[10] Li Y, Gao L, Ma D et al. Identification of MET exon14 skipping by targeted DNA- and RNA-based next-generation sequencing in pulmonary sarcomatoid carcinomas. Lung Cancer. 2018 Aug;122:113-119.
[11] 《NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines) 2022》
[12] https://www.hcp.novartis.com/
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发布于：北京