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●前言

2021年12月威尔康奈尔医学中心和纪念斯隆凯特琳癌症中心的Linda T. Vahdat 和 Vivek Mittal教授课题组在Nature Communications期刊发表的题为“Copper depletion modulates mitochondrial oxidative phosphorylation to impair triple negative breast cancer metastasis”的研究成果，通过蛋白质组学和代谢组学研究方法，发现了高度转移性 SOX2/OCT4+ 细胞的离散亚群表现出细胞内铜水平升高特征，探究了TM 介导的复合物 IV 失活确定为 SOX2/OCT4+ 细胞群中的主要代谢缺陷，AMPK/mTORC1 能量传感器为重要的下游途径。描绘了铜-代谢-转移轴，为高风险三阴性乳腺癌患者的下一代治疗方法提供了理论依据。

中文标题：铜耗竭调节线粒体氧化磷酸化以损害三阴性乳腺癌转移

研究对象：高风险三阴性乳腺癌 (TNBC)

发表期刊：Nature Communications

影响因子：14.919

发表时间：2021年12月

合作单位：纪念斯隆凯特琳癌症中心，Sandra 和 Edward Meyer 癌症中心

运用关键生物技术：TMT标记定量蛋白质组学和靶向代谢组学

●研究背景

三阴性乳腺癌(TNBC) 的特征是缺乏雌激素受体 (ER-)和孕激素受体(PR-)表达，也缺乏HER2表皮生长因子受体 (HER2-)的过度表达。TNBC占所有乳腺癌的10-15%，并且由于对当前靶向治疗缺乏反应和较高的转移率而导致不良结果。鉴于FDA批准的有效分子靶向抗转移疗法的可用性有限,需要为TNBC 患者开发新疗法做进一步的探究。

金属作为许多有助于肿瘤生长和转移的金属酶/蛋白质的辅助因子，并且靶向金属已成为潜在的抗癌治疗策略。铜是许多导致恶性进展的金属酶的辅助因子。口服生物可利用的铜螯合剂四硫钼酸盐(TM)对高风险三阴性乳腺癌 (TNBC) 患者有明显益处。但人们对铜耗竭影响转移的机制知之甚少~

●研究思路

●研究结果

1.铜相关蛋白在乳腺癌中的重要性

在METABRIC数据集中，由SLC31A1编码的高亲和力铜摄取蛋白 1 (CTR1)基因为目标。与具有低SLC31A1表达的患者相比，具有较高SLC31A1表达的患者显示出明显较差的总生存期 (OS)。进一步分析显示晚期/转移性肿瘤（III-IV 期）患者SLC31A1表达增加。此外，侵袭性乳腺癌亚型患者：TNBC 和 HER2+SLC31A1的表达高于管腔A型或B型亚型。这些发现表明阻断铜摄取可能是转移性疾病的治疗策略。

NCT00195091的II期临床试验显示，NED4期（无疾病证据）患者不同分子亚型的结果没有差异。事实上，在9.4 年的中位随访中，对于管腔乳腺癌，预后最差的患者的 EFS 为 63.6%，Her2+ 为 50%，TNBC为59.3%。59.3% 的EFS在无疾病证据的 TNBC 4 期患者中尤为显著，因为在之前的试验中观察到的中位 EFS 不到 8 个月.这些观察结果为开发铜螯合作为晚期乳腺癌患者的治疗策略提供了强有力的依据。

之前实验表明，在 TNBC 原位模型（MDA-MB-231-LM2 或 LM2）中，铜耗竭不会影响细胞的原发肿瘤生长，但会显著减少肺转移。作者利用了TNBC 的同基因 EO771 小鼠模型，生成了肺热带变异细胞系 EO771.ML1（ML1）。然后作者原位注射到乳腺脂肪垫后积极转移到肺组织。施用口服TM治疗荷瘤小鼠群组。体内铜水平有效降低，切除原发性肿瘤2周后，TM 治疗不损害原发肿瘤的生长，TM 降低了肺转移负担。这表明即使存在完整的免疫反应，铜耗竭也会损害转移性疾病的进展。

图1 | 铜耗竭影响侵袭和转移

2.铜耗竭高度转移性 SOX2/OCT4+ 细胞群研究

使用TMT标记定量蛋白质组学分析，与GFP-群体相比，在GFP+细胞中TM处理后，线粒体复合物IV的多个亚基被特异性下调，对下调的蛋白质进行基因本体 (GO)分析，显示参与线粒体电子传递链 (ETC) 的通路富集。同时作者还分析了从人 LM2 细胞系中分选的 LM2 GFP+和 GFP- 细胞，在 TM 处理 48 小时后蛋白组学分析，揭示了GFP+细胞优先富集，同时揭示了线粒体 ETC 相关的通路。因此，TM 处理特别影响具有更高细胞内铜水平的 SOX2/OCT4+ 细胞中的线粒体 ETC 通路。

图2 | 铜耗竭靶向 SOX2/OCT4+ 可转移性细胞

a) 串联质量标签(TMT) 同量异位标记多重定量蛋白质组学分析载体和TM (0.5 µM) 处理的ML1 SOX2/OCT4+ GFP+报告细胞。

b) 串联质量标签 (TMT) 同量异位标记多重定量蛋白质组学分析载体和TM (0.5 µM)处理的ML1 SOX2/OCT4- GFP-细胞。

c) GFP+下调的蛋白质的基因本体论（GO）分析

d) GFP-下调的蛋白质的基因本体论（GO）分析

3.铜耗竭破坏 TNBC 细胞的线粒体呼吸

蛋白质组学分析确定了富含线粒体功能的途径。细胞色素c氧化酶 (Complex IV) 是一种线粒体金属酶，是线粒体ETC的终末酶。在没有这些铜的情况下，两细胞色素c氧化酶全酶无法组装和发挥作用。因此，作者假设 TM 介导的铜耗竭导致在蛋白质组学分析中检测到的复合体 IV 亚基降解。蛋白质印迹分析证实了复合物 IV 亚基的减少。铜耗竭影响了复合体 IV 的蛋白质水平而不影响其mRNA 水平（图 3b）。TM介导的复合物 IV亚基丢失不影响细胞色素c的表达，但导致细胞色素c氧化显著减少。TM 介导的mtDNA含量没有变化。透射电子显微镜表明，TM 处理扰乱了线粒体嵴的结构，TM 处理细胞中扰动嵴形态的数量显著增加。这些结果表明 TM 介导的线粒体结构和功能的改变可能会重新编程细胞生物能学。

图3 | TM 治疗影响线粒体复合物IV

a) Western印迹示出以下72-H TM处理（0，0.1，0.2，0.5μM）在LM2细胞呼吸复合物。

b) qPCR 分析显示对照和 TM (0.5 µM) 处理LM2细胞中人复合体IV 亚基4I1 (COX4I1)的转录水平，

c) 有和没有TM处理（0.5µM）的细胞色素c的蛋白质表达（n =4/组）。

d) 在LM2细胞中用TM(0.5µM)处理72小时后，在2小时内动态测量人细胞色素c氧化酶活性

e) 通过qPCR测定的LM2细胞中的线粒体DNA含量(p =0.060)。

f-h）MitoTracker深红色分析在对照和TM(0.5µM)处理的LM2(f)、ML1(g)和MDA-MB-468细胞，处理72小时（n =3/组）。

i) 通过透射电子显微镜（×50,000）确定的线粒体内膜嵴结构，红色箭头表示LM2细胞中正常/折叠和扰动的嵴形态。

4.铜耗竭破坏SOX2/OCT4-GFP报告阳性细胞的呼吸

作者观察到与未处理的GFP-细胞相比，GFP+细胞的线粒体与糖酵解ATP产生率比高1.8倍。此外，在TM处理后，GFP+细胞中线粒体与糖酵解ATP产生的比率显着降低了6.6倍，而在GFP-细胞中，线粒体与糖酵解ATP产生率的比率仅降低了1.6倍TM处理后。这些结果表明铜耗竭介导的OXPHOS减少会损害体外侵袭并在体内靶向特定的转移性肿瘤细胞群，并且TM靶向依赖于OXPHOS的转移性肿瘤细胞亚群。

结果还表明，将铜的可用性限制在线粒体中会引发显着的代谢、侵袭和抗转移表型，这与铜螯合一致。由线粒体特异性铜消耗或COX20表型直接靶向引起的复合体IV功能障碍会导致TM诱导的代谢缺陷。

图4 | 铜耗竭破坏SOX2/OCT4+转移细胞中的线粒体呼吸

5.铜耗竭激活AMPK以抑制mTORC1信号传导

营养分析表明，用TM处理增加了葡萄糖消耗和乳酸产生，这是一种由在LM2细胞中观察到的较高的基础细胞外酸化率。通过代谢物分析观察到，TM增加了核苷酸前体的水平，作者评估了TM对ATP生产的影响。正如预期的那样，与人和鼠TNBC细胞中的糖酵解ATP产生相比，TM显著降低了线粒体（氧化）ATP产生。

作者观察到LM2细胞中TM介导的铜消耗增加了Thr172处的AMPK磷酸化，同时复合物IV的减少，表明AMPK的激活和下游酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化）在Ser79处也增加。与TM一致，COX17敲低也显示线粒体ATP产生减少和磷酸化AMPK水平增加。增加了raptor(Ser792)的磷酸化，并降低了mTORC1下游靶标P70S6K（Thr389）的磷酸化。总的来说，这些数据表明TM介导的ETC破坏会产生生物能量应激，导致下游AMPK激活和mTORC1活性降低。

图5|铜耗尽激活AMPK

6.AMPK激活减少入侵

AMPK是一种已知的能量稳态、细胞生长和自噬调节剂；然而，最近的研究表明AMPK信号传导与细胞迁移和侵袭有关。为了确定AMPK激活是否有助于减少侵袭，使用了药理学AMPK激活剂：AICAR（腺苷类似物5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷）和A-76966253。用任一种药物处理LM2细胞导致侵袭显著减少。研究表明两种药物治疗后磷酸化的AMPK和磷酸化的ACC增加。

为了确定TM介导的侵袭缺陷是否通过AMPK活化介导，作者使用siRNA抑制AMPK的表达并观察到MPK抑制挽救了TM介导的侵袭表型丧失。这些结果共同表明AMPK是TM介导的侵袭缺陷的下游介质。

图6|AMPK是下游TM表型的介质

●研究结论

文章使用TMT标记定量蛋白质组学的方法，分析鉴定了差异表达的蛋白质，对下调的蛋白质进行基因本体论(GO)分析，显示下调参与线粒体电子传递链（ETC）的途径富集，证明了TM处理特别影响了具有较高细胞内铜水平的SOX2/OCT4+细胞中的线粒体ETC途径。确定TM介导的铜依赖性线粒体复合物IV失活是SOX2/OCT4+群体中的主要代谢缺陷。研究结果确定了铜-代谢-转移轴，并强调了其作为高危TNBC患者的下一代治疗方法的潜力。

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文末看点 | lumingbio

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