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在临床上，感冒是一种最常见的疾病。感冒分为流行性感冒（即流感）和普通感冒。谈到流感大家一定深有感触，在每年的冬春季，伴随着临床大量的流感样病例的就诊以及工作负荷的增加，我们知道流感来了。
流感是急性呼吸道感染性疾病
从定义我们可以看到这五点信息。
第一，流感的病原体是流感病毒，非常明确。感染人的流感病毒主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒，根据流感病毒表面的糖蛋白HA和NA又分为不同的亚型流感。A型流感主要有16种亚型，而B型流感感染人的主要是Bv By。
第二，流感是急性的感染性疾病。在机体接触病原体后，病原在机体潜伏2~4天，然后随着可以检测到病毒的核酸病毒颗粒，体内的病毒载量逐步升高，伴随着机体的免疫应答，病毒载量又迅速降低，所以排毒期为3~7天，而病程是5~10天。
第三，流感感染的靶细胞主要是呼吸道的上皮细胞。当流感病毒感染呼吸道上皮细胞后，上皮细胞可以释放很多趋化因子，从而募集体内天然免疫的吞噬细胞以及NK细胞，这样大量的趋化因子以及炎性因子就可以介导全身的中毒症状，产生中高度的发热以及肌痛和乏力。
第四，流感病毒具有传染病基本要素。传染源是患者和隐性感染者，传播途径包括飞沫传播以及气溶胶介导的空气传播。
第五，对于流感这种传染病来说，它的防治策略非常明确。首先要控制传染源；其次针对飞沫可以保持社交距离以及物理隔离，从而控制携带病毒的口鼻分泌物污染；还有通过负压装置，可以将病原体集中在一个可以控制的区间内。
流感防治的重点是什么？
突发、重症、传播快、涉及范围广的流感是流感防治的重点。流感对人类的威胁主要有三种形式，包括季节性流感、流感大流行以及人感染动物流感病毒。
从这张图可以看到，流感病毒包括不同的型和亚型，特别是感染人的动物流感病毒主要是甲型流感病毒，丙型流感病毒也可以感染儿童。关于流感的防治，特别是临床中最主要的是有效降低流感造成的巨大的疾病负担，以及减轻临床的重症病例，降低病死率。
临床如何有效控制传染源？
临床有效控制传染源有这三点：及时发现、诊断病例、进行治疗，特别是对重症病例尽早抗病毒治疗。大家已经明确知道以下五类人群是容易发生合并症、重症的高危人群，所以是我们抗病毒治疗的靶向人群。
- 年龄<5岁的儿童（<2岁更易发生严重并发症）；
- 年龄≥65岁的老年人；
- 伴有以下疾病：慢性呼吸系统疾病、心血管系统疾病、肾病、肝病、血液系统疾病、神经系统及神经肌肉疾病、代谢及内分泌系统疾病、恶性肿瘤、免疫功能低下或抑制；
- 肥胖者（BMI>30）；
- 妊娠及围产期妇女。
抗流感病毒策略有哪些？
抗流感病毒的策略主要有两类，一类是靶向宿主，另一类是靶向病毒。靶向宿主包括疫苗、病毒受体、宿主因子。
靶向病毒主要分为免疫治疗（immunotherapy）和化学治疗（chemotherapy），化学治疗主要是利用一些小分子药物，靶向参与病毒感染、复制重要生命周期的重要的功能蛋白，如流感病毒的HA蛋白介导病毒的吸附过程，M2蛋白介导病毒的脱衣壳的过程，RNA依赖的RNA聚合酶（RdRps）介导病毒的复制，NA介导病毒从靶细胞脱落释放到组织间隙中。
我们再来了解抗流感病毒药物
这是目前处于临床试验的抗流感病毒药物
针对靶向宿主的药物主要有唾液酸酶以及抗寄生虫药物，这类药物可以抑制HA在宿主细胞的成熟。另一类主要是靶向病原，这类目前主要是集中抑制流感病毒的复制。还有一类是针对HA进步的广谱中和抗体。
这是临床已批准的三类药物
第一类是M2通道阻断剂，这类药物主要针对甲型流感M2蛋白的跨膜区，代表药物有金刚烷胺和金刚乙胺。在1967年就被批准适用于成人和儿童甲型流感病毒感染，但是随着跨膜区蛋白M2区域出现多个氨基酸位点的变异，它的耐药在甲型流感病毒非常广泛，所以目前不被推荐用于甲型流感病毒的治疗。
第二类是NA抑制剂，也是目前应用最广泛的药物。主要针对甲型以及乙型流感病毒的NA蛋白，包括奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉尼娜米韦这四种药物，前三种药物在我国临床是被批准使用的。它的重点就是在暴露后48小时内用药，儿童甚至可以提前到36小时内。有关奥司他韦以及扎那米韦跟药物耐药的变异位点有D198N，I222V，H274Y，R292K，R152K，R292K，这是临床标本中常发现的变异。
第三类就是RdRps抑制剂，这是最新的针对病毒复制的药物。主要针对甲型和乙型流感病毒，包括核苷酸类似物T705，这类药物主要在日本被批准使用；还有巴洛沙韦，巴洛沙韦已经在日本和美国被批准使用了。在临床标本中发现使用巴洛沙韦之后，可以在PA蛋白38位和23位出现变异。
HA/NA在流感病毒生命周期中的作用
HA和NA是流感病毒重要的功能蛋白，HA主要是识别靶细胞上的唾液酸受体。从图中看出，唾液酸受体在糖受体的最外端，它是由9个碳原子组成的唾液酸，第二个糖是半乳糖。我们常说的2,3连接和2,6连接就是指唾液酸第2位碳原子和半乳糖之间的连接，NA切割位点也是这一个。所以说HA和NA的功能是平衡作用，当NA酶活降低时，HA对唾液酸的亲和力也会降低。
这是临床上已批准使用的神经氨酸酶抑制剂(NAI)
NA抑制剂既适用于临床治疗，也用于暴露后的预防。NA抑制剂的共同特点是同唾液酸有类似结构。
从这张图上可以看到，机体里的唾液酸由9个碳原子组成，在第1位、第4位、第5位、第8位以及第9位碳原子连的基团都是通过这些基团同机体的NA蛋白相互作用，因此利用这些相连的基团的特性，我们进行药物的改造。亲水基团主要是第1位的羧基基团和第4位的氨基/胍基基团，疏水基团主要是第3位的丙基基团或戊氧基基团。所以利用这个原理，我们就知道它的耐药发生机制。
NAI药代动力学
奥司他韦主要是口服药物，口服之后经肠道上皮的酶的作用后，把磷酸切割，它的活性位点就会暴露转化成活化形式。所以口服3~4个小时，血药浓度达到峰值，它的半衰期是6~10个小时。主要通过肾脏代谢，对于肾功不全者需要调整给药剂量。而扎那米韦的给药方式是以吸入的方式，它的生物转化活性效率是最高的，大概吸入1~2个小时后达到血浆峰值，半衰期可以维持4~5个小时。吸入后的代谢途径是16%由尿液排出，所以对于肾功不全者，吸入给药不需要调整剂量，因此扎那米韦是适合呼吸道给药的。
儿童流感奥司他韦用药有哪些特点？
儿童使用奥司他韦有注意事项，由于儿童肠道对奥司他韦的活性转化功能较低，所以儿童使用的剂量比成人高。成人75mg/kg，相当于1mg/kg剂量，而儿童是可以高达3mg-3.5mg/kg。但是对于需要血液透析的儿童，需要调整剂量。另外，我们经常在儿童给药的时候会同牛奶一起服用，这时药物的生物活性会明显降低（从32.5%降到11.7%）。如果高脂饮食或者抑制肠道细胞内的转肽酶，药物的生物活性也会降低。
那么，临床是如何发现NA抑制剂的呢？
这张图显示的是荷兰研究团队在2010年报道的一例5岁白血病患儿感染2009H1N1病毒的病例。入院时患儿的病毒载量已经很高了，给予口服奥司他韦治疗后，病毒载量迅速降低，但是随后病毒载量又增加，研究人员检测到了H275Y变异，同时给予扎那米韦治疗，病毒载量再次降低，但是在这个过程中能够测到病毒载量增加。由于试验，始终没有发现NA片段，直到停药扎那米韦后，又发现了I223R突变，这个变异始终维持高病毒载量。从这个过程中我们发现，如果单一使用NA抑制剂，或者是在检测中忽略了对NA片段的变异的监测，临床上有可能出现NAI耐药毒株。
下面来了解NAI耐药的发生机制
NA重要功能区（以N2/Bv蛋白氨基酸序号为参考）
对于NAI耐药需要重点了解的是NA蛋白的功能，NA蛋白有酶活中心，刚才我们提到唾液酸的第1位、第4位、第5位、第8位以及第9位碳原子连的基团是会同NA酶活中心的重要基团相互作用的，特别是结合底物位点，包括R118，D151，R152，R224，E276，R292，R371，Y406这8个位点，而这8个位点在不同的型和亚型流感病毒是非常高度保守的，也就是说当这些位点变异时，会影响病毒的复制力和传播力，也就是我们常说的病毒的适应能力。而E119，R156，W178，S179，D198，I222，E227，H274，E277，N294，E425这11个位点是支撑NA的酶活中心位点，它的变异对病毒的适应能力影响不大。
NAI(唾液酸类似物)耐药机制-与NA作用的重要基团
从这张图我们可以看到，奥司他韦主要的功能区域基团集中在第1位碳原子连的羧基乙基、第3位碳原子连的疏水的戊氧基或丙氧基基团或乙酰氨基基团，而扎那米韦在第4位碳原子引入了亲水的胍基基团。因此通过这些基团同NA不同位点的相互作用，当发生耐药时，常常是这些相互作用的NA位点发生变异。但是我们需要记住的一点就是NAI耐药基因型与表型间的相关性难预测，所以我们必须在体外进行生物活性的检测，也就是我们常说的生物表型的检测。
NAI耐药机制
我们常说的274变异是什么意思？这就是H275Y变异，以N1蛋白氨基酸序列来排序，它是275；如果是以N2蛋白氨基酸序列来排序的话，它就是在274。当H到Y变异的时候，由于疏水性的作用，它使奥司他韦同NA蛋白的距离增加。奥司他韦距离NA更远后，奥司他韦同NA蛋白的结合是缓慢结合，但同时由于侧链构象扭曲，使它的结合不稳定，因此它会出现缓慢结合又快速分离。所以要让NA抑制剂同NA相互作用的话，它需要更高浓度的NA抑制剂，就是我们常说的耐药。
其他在研NAI-与NA共价相连的NAI
因此基于结构生物学，大家就想能够发现一些共价作用的NA抑制剂。基于唾液酸的结构，在唾液酸的第2位和第3位引入氟原子，有发现一些共价结合的NA抑制剂。这项研究主要是集中在动物实验和体外实验，还没有进入临床实验。
NAI耐药的表型检测
NAI进行生物表型检测是非常必要的，它的生物表型检测主要分为两类。首先是对病毒的酶活测定，然后测定在不同药物浓度下病毒酶活的变化，从而计算出药物的半数抑制浓度，同时对测试病毒的IC50值与对照病毒IC50值进行比值的计算。这些所列出的病毒常常是作为耐药病毒的阳性对照。WHO对表型的判定进行了界定，对于甲型流感病毒，如果它的倍数增加在10~100之间，我们叫做它的敏感性降低（RI），如果超过100，我们叫做明显降低（HRI）；对于乙型流感病毒，由于乙型流感病毒的NA酶活比甲型低，所以它的波动比例是在5~50和大于50。
季节性流感病毒的NAI耐药情况如何？
从这张图上可以看出，从自然界分离的流感病毒的耐药比例非常低，包括明显降低和降低。这些耐药比例常常是针对奥司他韦耐药，对奥司他韦耐药的流感成人占0.32%，儿童占4.1%。不同型、亚型对NAI耐药的流感病毒变异不同。临床分离株常见变异：A（H1N1）H275Y；A（H3N2）D199G，N292K；B；A200T，R150K，D197N。
那么，有没有自然发生的耐药？
从既往报道发现，自然发生的H274Y变异的2009pdmH1N1耐药株的聚集性流行。
临床发现的NAI耐药的H7N9禽流感病毒
在我国，临床常常使用NA抑制剂治疗H7N9禽流感病毒的感染。在药物的作用下，特别是在奥司他韦的作用下，我们从病人的分离株发现它的NA蛋白有很多氨基酸位点的变异，在体外进行表型测试，发现主要是292，274，222，119位点变异，同它的生物表型密切相关，特别是292位点变异，它可以引起多重耐药的表现。并且我们发现如果使用扎那米韦在体外对H7N9病毒进行培养传代，未发现耐药变异。NAI耐药性变异对珠三角分支的H7N9病毒NA酶功能影响小。
总体来说，大家要记住以下五点
1.NAI应尽早给药，并且选择生物活性高的药物或给药方式；
2.目前季节性流感病毒自然发生的NAI耐药变异低，而H274Y变异不降低2009H1N1病毒传播力；
3.H7N9在奥司他韦作用下易发生变异，建议考虑联合用药；R292K降低病毒适应性；
4.快速发现NAI耐药：随时监测病毒载量、病毒基因型；生物表型实验后期核实；
5.NAI在特定情况下可选用于暴露后预防性用药。
下面简单介绍RdRps抑制剂
这是目前最有进展和前景的抑制流感病毒复制的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRps）抑制剂。这是高度保守的区域，而且针对病毒RNA复制及转录，因此它是一个极其有效的抗病毒药物。
1、T705（6-fluoro-3hydroxy-2-pyrazinecarboxamide,favipiravir）
现在主要有嘌呤碱基类似物T705，服用T705后，主要是在细胞内转化成一个活化形式的T705 RTP，然后病毒RNA聚合酶就会把T705 RTP和嘌呤类核苷酸类似物误认为是机体里正常的嘌呤类核苷酸，所以它主要干扰病毒的复制过程。
• T705是广谱抗RNA病毒药物
T705可以针对多种数的RNA病毒，并且针对不同型和亚型的流感病毒，它的体外抑制效率大概是微摩尔水平。
2、利巴韦林（Ribavirin）
另一类药物是已经在临床使用非常多的利巴韦林，它也是嘌呤核苷酸类似物，但主要是抑制宿主脱氢酶，所以它的抑制效率比T705低，抗流感病毒并不推荐使用。
3、巴洛沙韦（Baloxavir marboxil）
还有一种非常有效的药物是巴洛沙韦（BXM）。口服巴洛沙韦后，会快速在血浆内转化成一个活化形式的巴洛沙韦酸（BXA），它的结构像蝴蝶一样对称，所以巴洛沙韦酸主要同PA核苷酸内切酶重要的5个氨基酸位点相互结合（20、24、34、37和38）。尽管A型流感和B型流感在这些位点不同，但是巴洛沙韦抑制A型和B型的效率基本相近，它主要是终止病毒mRNA转录起始，在终止mRNA转录的同时抑制病毒复制，也就是vRNA和cRNA的合成会明显降低。
目前对这些药物的药代动力学研究资料并不多，特别是T705，主要是在动物实验。研究发现，病毒感染会影响药物服用到达的有效的血药浓度，并且药物可以在组织里蓄积。而巴洛沙韦是一个非常有效的药物，服用大概3.5个小时就可以快速到达血药浓度，而且可以持续49~91个小时，它主要由粪便排出，所以它的治疗效果非常好。
我们再来看看RdRps抑制剂的耐药情况
目前临床没有发现T705耐药
巴洛沙韦耐药相关变异
通过巴洛沙韦的临床Ⅱ期以及Ⅲ期试验，可以看到较H1N1和B型流感，H3N2病毒中出现PA I38变异更频繁，并且小年龄儿童患者更容易发生耐药性变异。
生物表型检测
我们强调在进行耐药基因型的同时一定要做生物表型的验证。对于抑制病毒复制的药物，它的生物表型检测主要有两种方法，一种是通过体外多轮感染来测试，另一种是通过体外一轮感染来测试，同时像NA抑制剂一样要计算出它的EC50的变化情况，但是目前WHO没有推荐阈值。
BXA耐药阈值？>3？
所以结合临床现有的分离株和体外实验来进行表型和基因型的关联，无论是在H3N2、H1N1以及B型流感，最常见的变异是I38T变异。目前以三倍的差别作为BXA耐药的判断。
BXA耐药的监测资料主要来源于美国和日本的数据
美国在2016年、2017年、2018年的流感流行季节，发现巴洛沙韦的耐药变异率非常低。在美国的2009H1N1病毒分离株的耐药主要是I38T/L变异，而I到T的变异会影响H1N1病毒的适应能力。I38L变异的相关实验还正在进行。
日本报道2018-19年流感流行季节，H3N2耐药比例明显高于H1N1和B型流感。并且在一个家庭的感染病例中发现10岁儿童和8个月大的婴儿都是感染了耐药的PA I38T变异，而且这个病毒分离出来发现直接对巴洛沙韦明显耐药，因此提示这个变异的病毒可以流行传播。
小结RdRps抑制剂
1.对于抑制流感病毒复制的药物T705，它是多次给药能有效降低病毒载量，目前未发现耐药相关变异，但是缺乏药代动力学。
2.巴洛沙韦一次给药就能有效降低病毒载量，但是在儿童中容易发生耐药变异。值得关注的是I38T的变异，它可以明显降低2009H1N1病毒的复制力和传播力，但是对H3N2病毒的传播力不受影响。
3.目前快速筛选方案同NA抑制剂筛选方案一样的是测定病毒载量、病毒基因型，同时进行重化病毒的分离，对生物表型进行后期的核实验证。
参考文献
[1]P Koszalka., 2017
[2]Susanna Esposito & Nicola Principi., 2016
[3]Erhard van der Vries。， et al., nengl j med. 2010
[4]van der Vries E, et al., 2012
[5]Kim., et al., 2013
[6]Weekly epidemiological record ., 2012
[7]http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/en/
[8]Emi Takashita., et al.,2015
[9]Kiso et al.,2010 & Takahashi et al., 2011; Furuta Y., et al.,2013
[10]XOFLUZATM. 2018; Hayden FG, 2018; Gubareva LV., 2019; Omoto et al., 2018;Takashita E et al., 2018
[11]Gubareva LV., 2019
[12]Takashita E et al., 2019
专家介绍
周剑芳
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，研究员，博士生导师。自2003年起至今，致力于流感病毒的研究，涉及病毒重配进化、致病机制及宿主免疫反应和抗病毒治疗等领域。承担多项国家级课题包括863、973、自然科学基金等资助项目。参与新发流感病毒包括2009H1N1、H7N9、H10N8禽流感病毒的发现及其生物学特性、致病机制等领域研究。目前主要研究方向是流感病毒广谱中和抗体的检测、筛选及遗传基础。