微生物组学的过去、现在和未来
导读
在过去十年中，核酸测序和质谱技术的进步使得能够更快速，更有信息地进行宏基因组，转录组，蛋白质组学和代谢组学的分析。在这里，我们回顾了多环境和人类微生物多组学分析的关键，讨论了为了解决当前缺陷未来的一些潜在的发展方向。
前言
微生物在大约35亿年前在地球上开始出现，最终占领了地球生物圈的每个位置。虽然已知微生物负责对地球上的很多关键功能，例如碳和营养循环，以及决定地球植物和动物的健康和疾病，但目前认为存在的万亿微生物中有99％还没有被发现。此外，由于复杂的微生物群体多样性导致研究微生物群体中特定的功能变得非常复杂，微生物群体（定义为特定环境中存在的微生物及其集体遗传物质的总体，例如居住在土壤或人类肠道中的所有微生物）。幸运的是，过去几十年的技术进步大大促进了复杂微生物及其功能的研究。这里我们将讨论与核酸测序和质谱（MS）分析相关的进展，这些分析是的我们能够分析环境和体内的微生物群体。
核酸测序
核酸测序技术的速度和通量的惊人增长促进了微生物研究进展。特别是下一代（NextGen）测序有了革命性的发展，它们已经超过了近三十年（1977年至2005年）占主导地位的传统Sanger测序方法。使用基于Sanger双脱氧核苷酸的连锁终止方法对单个细菌基因组进行测序以前是一项需要多年才能完成的重大努力。使用Sanger方法完全测序的第一个细菌基因组是1995年的嗜血杆菌流感（1997年完成了大肠杆菌）。目前，由于可用快速和便宜的NextGen测序平台，现在可以在几个小时内完成细菌基因组测序。
NextGen测序方法经历了几个不同平台的时代。第一个是Roche GS20 454测序仪，其基于焦磷酸盐的聚合酶切割，也称为焦磷酸测序。虽然454测序是关键的技术进步，并且使用了包括GS20和GS FLX系列机器和试剂在内的454种定序器已有十多年（大约2005年至2016年，http：//www.genomeweb.com/sequencing/roche-shutting-下列454-测序业务），它具有几个缺点，包括测序试剂的高成本，高均聚物误差率（即通过复杂重复读数的误差）和表面由于基于珠的DNA分子沉积导致的面积负载限制，从而限制了所获得的读数和通量。第二个NextGen测序仪是Solexa（现在的Illumina）基因组分析仪（GA），2006年推出，并纳入寡核苷酸阵列流动细胞，可逆链终止子和桥接PCR反应。该技术现在常规用于对人和环境微生物提取的DNA和RNA进行测序，并且可以在单次运行中产生> 1.8（TB）的数据。但是，终极目标是按照每个人类基因组1000美元（http://www.illumina.com/systems/hiseq-x-sequencing-system/ystem）每年对> 18,000个人类基因组（〜3吉比单位（Gbp）单倍体基因组）进行测序。 HTML）。 Illumina目前有几个技术平台，包括GA，MiSeq和HiSeq机器，具有不同的读取长度（100-300 bp的双端读取）和通量，以尝试和解决这一挑战。例如，MiSeq平台上重叠配对读取的最大读取长度为500-550 bp，但该平台的通量比HiSeq平台低，每次运行会产生数十亿次读取（图1）。 Illumina开发的一种相对较新的方法，称为TruSeq合成长读数或Moleculo，导致更长的读取长度（> 8 kbp）15，并促进了高度复杂的土壤微生物群落16和其他生物样品的组装。这些技术进步的初步结果是将微生物组装增加到更长的contig。
图1：测序进步进展
单分子测序技术
新兴测序技术包括基于单分子的DNA测序仪可以更快的进行微生物基因组的研究。一个例子是来自PacBio的单分子实时（SMRT）技术，其依赖于拴住的DNA聚合酶和零模式波导，以通过少量液体引导光能。 PacBio目前提供长度为10-25 kbp的DNA序列读数和每个SMRT小室〜300 Mbp（http://www.pacb.com）。由于使用束缚聚合酶，PacBio平台可以检测异常由于聚合酶的摆动，可以直接读取DNADNA修饰情况。牛津Nanopore测序平台是另一个新兴和有希望的单分子测序仪。与目前的平台不同，牛津平台不依赖于合成测序，而是通过穿过Nanopore直接对核酸分子进行排序。 Oxford Nanopore可以检测到像PacBio platorm的DNA修饰，平均读取长度为〜1-2 kbp，以及任何测序仪（> 90 kbp）提供的最长读取长度。牛津Nanopore测序器的主要优点是其拇指大小，可以在个人实验室电脑上用实时使用无线技术进行分析。（https://nanoporetech.com/ about-us / news）
在过去五年中，PacBio平台已经成为用于测序微生物样品的强大技术，用于从头和宏基因组装配。 值得注意的是，PacBio平台需要微量的高分子量DNA（> 40 kbp）进行文库制备，限制了其可以测序的样品。 Oxford Nanopore提供了一种廉价的方法来潜在地测序大的片段（> 50 kbp）。 然而，这些新技术的主要挑战是获得数百千碱基或甚至兆碱基长度的高质量和大分子量的DNA。 Oxford和PacBio平台对于大规模研究而言仍然过低，但是对于序列组装应用，这些单分子序列为微生物群落提供未来的前景。
测序复杂微生物群落
DNA测序技术的改进使许多发现世界各地和我们自己身体中的微生物成分和潜在功能。 大部分关于微生物的信息都来自NextGen测序的16S rRNA基因作为细菌和古细菌的系统进化标记。 另外，总DNA（即基因组学）的NextGen测序已经可以确定在不同环境中与特定微生物群体相关的功能基因。 例如，一些研究已经定义了在深水地平线溢油在墨西哥湾和解冻永久冻土之后的水和沉积物样品中的功能基因组成。 然而，绝大多数这些基因没有已知功能，反映了尚待发现的环境微生物的巨大多样性和生化潜力。
宏转录组学
Metatranomics测序总mRNA（即，metatranomics）揭示哪些基因被表达通过空间和时间尺度的特定生物体。 Metatranomics提供了微生物基因在各种生态系统中的表达知识，包括酸矿排水、肠、海洋和土壤。例如，吉尔伯特等人使用宏转录组来确定英吉利海峡海洋微生物群的季节性表达模式。最近，我们使用Metatranomics来推断土壤基因组中哪一个识别的生物体在土壤中有活性。虽然Verrucomicrobia在被调查的土壤中非常丰富，但很少的mRNA转录本映射到其基因组，这表明它们实际上是转录静止的。相比之下，Firmicutes基因组被发现是转录活跃的。这揭示了Metatranomics在验证宏基因组学和了解微生物群落不同成员的相对活动方面的效用。
基于质谱法的蛋白组学和代谢组学测量
虽然DNA测序的进展使得能够更好地了解微生物中的微生物系统发育和功能基因组成，但也希望了解在特定条件下产生哪些蛋白质（即宏蛋白质组学）和代谢物质（即代谢组学），以及扰动如何影响微生物功能。微生物在不同样品中产生的蛋白质和代谢产物的测量主要通过MS实现。在微生物样品的MS分析中，感兴趣的生物分子在源中离子化，根据其在质量分析仪中的质荷比进行分离，最后检测，提供具有高灵敏度，分辨率和产量的宏蛋白质组学或代谢组学测量。
1984年电喷雾电离（ESI）的引入大大增加了MS测量用于评估的效用。 ESI的一个挑战是执行它在大气压力（760乇）下，质量分析仪通常在10-6和10-11乇之间的压力状态下工作。这种压力差异超过九个数量级，如果源和质量分析仪区域耦合不好，则会发生巨大的离子损失。因此，在过去二十年中，已经优化了使用离子漏斗和透射四极区域的界面设计，以重新聚焦离子，同时不断降低压力。这些领域的改进导致离子损失减少和灵敏度更高。然而，分析复合微生物中的生物分子由于高动态范围和给定样品中存在数千个组分，MS仍然非常困难。这些挑战需要在分辨率，精度和MS / MS速度方面改进质量分析仪。四极杆，离子阱，飞行时间和离子回旋共振（ICR）质谱分析仪构成了2005年引入轨道曝光仪之前使用的大多数质量分析仪。orbitrap技术为实验室提供了更高的分辨能力，更为经济实惠。orbitrap技术在过去十年的进步包括更高分辨率的测量和更快的MS / MS，这里包括linear ion trap （低分辨率）和orbitrap（高分辨率）的扫描速率。最大分辨率和MS扫描速度过去15年显示，这两个特征都已被优化，以便在每个测量中获得最佳的生物分子覆盖和准确性。然而，由于微生物组织样品的复杂性，还采用了一维和二维液相色谱分离和气相离子迁移光谱等附加技术来增加鉴定的蛋白质和代谢物的数量。这些分离技术在检测前降低了样品的复杂性，由于每个微生物组分样品中存在许多分子，因此离子阱和检测器的抑制较少，并且可以使给定样品中的蛋白质和代谢物更高的覆盖范围。
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