玉米单倍体育种与常规育种诱选结合的育种方法及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种玉米单倍体育种与常规育种诱选结合的育种方法及其应用。


背景技术：

2.纯系的制备一直是作物育种的关键环节，常规育种方式主要采取自交或回交的方式进行材料背景纯化，一般需要8代以上，而使用单倍体育种技术(doubled haploid technology,dh technology)仅需2代即可获得纯系(gerald等，2013)。据cimmty估计，目前北美和欧洲主要种子公司，生产的玉米新品种亲本中，大约70％到80％含有一个或多个dh(doubled haploid)系，以dh为基础的玉米杂交种覆盖全球面积约6.0到7.5亿亩(cimmty，2015)。国外许多种业公司均已实现单倍体育种的规模化应用，国内单倍体育种起步较晚，目前国内玉米育种多是以常规育种与单倍体育种相结合的方式。玉米常规育种多采取二环系选育的方式，即逐代自交或回交，其具有遗传变异丰富，目标性状可控，更易于多个优良基因的聚合，每代均进行人工选择，遗传响应明显。但常规育种周期长、工作量大、工作繁琐。相比于常规育种，单倍体育种具备以下优点(1)大大缩短了育种周期，只需要两个世代便可得到性状稳定的纯系；(2)节省了自交系纯化过程中多年连续自交与选择所造成的大量人力、土地和资金成本(geiger and gordillo,2009)；(3)纯合遗传背景可以与分子标记技术相结合进行dh系的筛选，提高选择的准确性与效率(rober et al.,2005；geiger and gordillo.,2009)；(4)dh系是完全纯合的，利用dh系配出的杂交种更容易满足品种对差异性、稳定性、一致性的要求(geiger and gordillo,2009)。但同时单倍体育种也具有遗传交换频率低，目标性状不可控的缺点。为保持优良性状的同时，加快纯系的选育进程。目前多采取常规育种与单倍体育种相结合的方式。为减少无效dh的生产比率，一般以经筛选后的f2或bc1及其以上世代优良群体，作为dh生产的基础材料。但目前所采取的常规育种与单倍体育种相结合的过程，是育种的两个相对独立的阶段，并没能真正实现单倍体诱导和优良性状选择同时进行。因此，如何对dh生产基础群体的单株进行选择，择优诱导，对诱导所得果穗，择优筛选单倍体和加倍，真正做到诱选结合，是提高优良dh系生产效率的重要手段之一。为使育种目标更加明确，创制一种常规育种与单倍体育种诱选结合的方法对加速优良纯系的选育进程，减少无效操作具有重要意义，从而促进玉米育种技术的发展。


技术实现要素：

3.为解决常规育种周期长，单倍体育种可控性差的问题，实现单倍体诱导与目标性状筛选相结合的目标，本发明提供了一个可行的方案，可大大提高目标dh系的生产效率，进而降低育种成本，加快育种进程。
4.第一方面，本发明要求保护一种获得玉米dh系的方法。
5.本发明要求保护的获得玉米dh系的方法，可包括如下步骤：将玉米单倍体育种方法与常规育种方法相结合，通过诱选结合进行育种；所述诱选结合是指单倍体诱导当代同
时进行优良性状选择。
6.进一步地，所述诱选结合的发生世代可为具有目标性状分离的f2代或bc1代或f2代以上世代或bc1代以上世代。
7.进一步地，所述诱选结合的作用对象可为单倍体诱导杂交当代植株或果穗。
8.进一步地，所述诱选结合的作用方式可为对植株性状和/或果穗性状进行选择。
9.更进一步地，所述方法可包括如下步骤：
10.(a1)选择在目标性状存在差异的玉米自交系，组配杂交种，而后自交或回交，将获得的具有目标性状分离的f2代或bc1代或f2代以上世代或bc1代以上世代作为基础群体；
11.(a2)将玉米单倍体诱导系与所述基础群体进行杂交诱导，然后根据育种需求，对杂交诱导当代的植株性状和/或果穗性状进行选择，保留入选果穗，而后分别进行单倍体的鉴别与加倍，生产dh系。
12.在步骤(a2)中，进行单倍体诱导前，还可包括如下步骤：对步骤(a1)所得基础群体中的单株进行植株性状的选择，剔除不符合育种目标的单株，剩余单株严格去雄，雌穗严格套袋。待花丝出齐后择优诱导，为保证获得含有目标性状的dh系，一般保留尽量多的优良单株进行单倍体诱导。
13.在步骤(a2)中，所述入选果穗可为根据鉴定的一个或多个所述植物性状和/或果穗性状，将所述杂交诱导当代的果穗按照从优到劣的顺序进行排列，排序前20％的果穗。
14.在步骤(a1)中，所述目标性状可为一个或多个所述植物性状和/或果穗性状。
15.在步骤(a2)中，将所述基础群体进行播种，同时错期播种所述玉米单倍体诱导系，以保证花期相遇。
16.在上文中，所述植株性状包括但不限于：散粉期、吐丝期，株高、穗位、叶夹角、叶长、叶宽、抗倒性、抗病性、抗旱性、耐盐碱等。所述果穗性状包括但不限于：穗长、穗粗和/或穗行数。
17.在本发明的一些案例中，步骤(a1)中，进行组配的玉米自交系为京1110与京j2418；步骤(a2)中，所述玉米单倍体诱导系为玉米单倍体诱导系cau6。
18.在所述方法中，可结合后期单倍体加倍方法，在特定时期采收杂交诱导当代的所述入选果穗，若采取幼胚加倍，则选在授粉后15-20天采收果穗，若采取单倍体籽粒或芽苗加倍，则选择成熟后收获果穗。
19.根据需要，在步骤(a2)之后还可包括如下步骤：对所得dh系的目标性状进行鉴定和比较，验证杂交诱导当代选择的有效性。具体操作可如下：在诱导杂交当代对植株性状和/或果穗性状进行筛选，对单一性状或多个性状或复合性状对诱导杂交果穗进行排序，分别选取前后20％，用于单倍体鉴别与dh生产。对以上分类所得dh系的分类指标性状进行比较，根据两者存在的差异显著性，可证明诱导杂交当代选择的有效性。
20.以上所述植株性状和/或所述果穗性状的筛选时期，均在单倍体诱导之前或杂交诱导当代进行，根据育种目标不同，可选择重点筛选植株性状或果穗性状或两者均筛选的方式。
21.第二方面，本发明要求保护前文第一方面所述方法在玉米育种中的应用。
22.实验证明：本发明将单倍体育种与常规育种方法相结合，实现了诱导与筛选同步进行的目标，通过对dh生产基础群体优良单株进行选择，结合关键植株性状，选择优良单株
进行诱导，在果穗收获期，对杂交诱导果穗进行再次筛选，根据重要穗部性状进行筛选，择优挑选单倍体进行加倍，生产dh系。该方法可大大提高优良dh系的生产效率，降低不符合育种目标dh生产的频率，减少无效劳动和成本，从而提高育种效率。
附图说明
23.图1为杂交诱导当代株高、穗位性状筛选所得dh比较。
24.图2为杂交诱导当代叶夹角、叶长、叶宽性状筛选所得dh比较。
25.图3为f2群体杂交诱导当代果穗穗长、穗粗差异表现。
26.图4为杂交当代选择后，分别诱导所得dh穗长、穗粗、穗行数分布情况。
具体实施方式
27.本发明技术方案具体如下：
28.1、材料准备
29.首先根据育种目标，组配用于生产诱导系dh的基础材料，基础材料亲本至少一个关键植株性状或果穗性状上存在明显差异。为获得目标性状分离群体，将上述亲本组配所得f1进行自交或回交，从而获得具有目标性状丰富变异的f2或bc1或其他高世代分离群体。
30.2、性状分离群体植株性状筛选
31.将分离群体进行播种，同时错期播种单倍体诱导系，以保证花期相遇。在利用诱导系对基础材料进行诱导之前，根据育种目标对基础群体单株植株进行筛选鉴定，鉴定指标可包括散粉吐丝期、株高、穗位、叶夹角、雌雄协调性等关键植株性状，淘汰不符合育种目标的单株，剩余单株严格去雄，雌穗严格套袋，待花丝出齐后择优诱导，为保证获得含有目标性状的dh系，一般保留尽量多的优良单株进行单倍体诱导。授粉完成后，在收获杂交诱导果穗之前，可进一步对植株抗病性(如锈病、斑病等)、抗倒性(如茎秆强度、茎秆折断力、气生根发育情况等)、抗逆性(如抗干旱、抗盐碱、抗病虫害等)等关键性状进行筛选，而后择优收获诱导杂交果穗，根据育种目标对所得果穗进行分类排序，分别选取前后20％果穗，对其单倍体进行鉴别和加倍，从而获得符合育种目标的dh系。
32.3、性状分离群体果穗性状筛选
33.同理，根据育种目标诱导基础群体，在进行单倍体鉴别和加倍之前，对诱导杂交当代果穗性状进行鉴定筛选，具体筛选指标可主要包括穗长、穗粗、穗行数等重要穗部性状，根据育种目标分别保留前后20％的诱导杂交果穗，再进行单倍体的鉴别与加倍，生产dh系。
34.4、诱导杂交当代选择的有效性验证
35.在诱导杂交当代对植株性状或果穗性状进行筛选，对单一性状或多个性状或复合性状对诱导杂交果穗进行排序，分别选取前后20％，用于单倍体鉴别与dh生产。对以上分类所得dh系的分类指标性状进行比较，根据两者存在的差异显著性，可证明诱导杂交当代选择的有效性。从而将诱选结合的方法应用于后续育种工作。
36.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
37.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.下述实施例中的高频单倍体诱导系cau6，其平均诱导率为12％，具有r1-nj标记，在文献“zhong yu,liu chenxu,et al.mutation of zmdmp enhances haploid induction in maize.[j].nature plants,2019,5(6).”中公开过，经同意公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0039]
以下实施例中玉米(zea mays l.)自交系京1110(植物新品种权申请公告号申请号20211000927)和京j2418(植物新品种权申请公告号申请号20201000757)均为公知材料，均由北京市农林科学院玉米研究中心自选育，公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。
[0040]
下述实施案例中单倍体加倍采用的是秋水仙素，为北京博友航生物科技有限公司产品。
[0041]
实施例1、基于植株性状的诱选结合方法
[0042]
一、材料选择与准备
[0043]
2020年春北京种植自交系京1110与京j2418，组配f1，在2020冬海南播种/杂交f1，获得f2种子，并于海南二季播种f2，获得f2群体(即基础群体)，并同时分期播种玉米单倍体诱导系cau6(携带r1-nj颜色标记，诱导率约为12％)，以便与基础群体花期相遇。
[0044]
二、单株筛选与单倍体诱导
[0045]
针对f2分离群体，剔除弱苗、倒伏、感病等具有明显不利性状的植株，调查单株散粉期、吐丝期，雌穗吐丝前严格套袋，防止外来花粉污染，待花丝出齐后，取诱导系cau6花粉，与基础群体单株进行授粉，完成单倍体诱导工作。
[0046]
三、杂交诱导当代植株性状的鉴定与筛选
[0047]
完成单倍体诱导授粉后，对授粉后10天左右单株的株高、穗位、穗位叶叶夹角、叶长和叶宽等植株性状进行测定。对目标植株性状进行考察排序，根据单一性状选择排序前后20％的果穗，其中前20％标记为a组，后20％标记为b组，结合后期单倍体加倍方法，在特定时期采收入选果穗，若采取幼胚加倍，则选在授粉后15-20天采收果穗，若采取单倍体籽粒或芽苗加倍，则选择成熟后收获果穗。入选果穗用于单倍体鉴别和加倍，从而生产dh系。
[0048]
四、杂交诱导当代植株性状诱选结合效果验证
[0049]
对诱导杂交当代单株株高、穗位、穗位叶叶夹角、叶长及叶宽性状进行调查，根据单一性状分别取前后20％，并标记为a,b组，针对目标性状分别对两类dh进行比较，每个dh选择四株进行性状采集，结果发现在株高与穗位方面见(图1，表1)，a组生产所得dh株高和穗位变异范围分别为188.00-259.00cm和45.67-128.33cm；b组生产所得dh株高和穗位变异范围分别为145.25-217.50cm和28.00-98.33cm；由图1两组生产所得dh株高和穗位分布情况可以看出，a组dh株高和穗位普遍高于b组，总体来看，a组生产所得dh的平均株高和穗位分别为211.08cm和86.56cm,均显著高于b组的183.26cm和60.83cm(p《0.05)，a组所得dh比b组所得dh平均株高和穗位分别高27.82cm和25.73cm。在叶部性状方面(图2，表2)，叶夹角、叶长和叶宽，经过分类生产dh后，两类dh被选择性状均存在显著差异(p《0.05)。根据叶夹角、叶长、叶宽进行分类生产所得dh两者平均差异也分别达到4.07
°
，6.90cm和0.82cm。且a组所得dh在叶夹角、叶长、叶宽三个性状分布均明显高于b组所得dh。由此说明，在诱导当代
针对植株性状对基础群体进行筛选，可更加有效的生产符合育种目标的dh系，也证明了杂交诱导当代，将单倍体育种与常规育种相结合，实现诱测结合的有效性。
[0050]
表1、杂交诱导当代株高、穗位性状筛选所得dh表现
[0051][0052]
注：同一项目内，不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。
[0053]
表2、杂交诱导当代叶夹角、叶长、叶宽性状筛选所得dh表现
[0054][0055]
注：同一项目内，不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。
[0056]
实施例2、基于果穗性状的诱选结合方法
[0057]
一、材料准备与单倍体诱导
[0058]
材料准备与单倍体诱导与实施例1相同，不对植株性状进行选择，取诱导系花粉与基础群体单株进行授粉，对基础群体所有植株进行杂交诱导，完成单倍体诱导工作。
[0059]
二、杂交诱导当代果穗性状的鉴定与分类
[0060]
结合后期单倍体加倍方法，在特定时期采收杂交诱导果穗，若采取幼胚加倍，则选在在授粉后15-20天采收果穗，若采取单倍体籽粒或芽苗加倍，则选择成熟后收获果穗。果穗采收后，在鉴别单倍体幼胚或籽粒之前，针对果穗穗长、穗粗、穗行数等关键果穗性状进行统计分类，针对单一性状选择排序前后20％的果穗，其中前20％标记为a组，后20％标记为b组，用于单倍体鉴别和加倍，从而生产dh系。
[0061]
三、杂交诱导当代果穗性状诱选结合效果验证
[0062]
根据杂交诱导果穗表现(图3)，针对长穗型、短穗型、粗穗型和细穗型f2单株，对目标性状进行排序，分别鉴别单倍体，对单倍体进行加倍，从而生产dh系。将所得dh进行田间种植，每个dh系取四穗进行目标性状测量，而后比较所得dh表现，结果表明，经对f2群体杂交诱导当代果穗进行筛选后，比较穗长，穗粗、穗行数方面分类所得dh发现，a组所得dh在这三个性状上的分布峰值所对映性状值明显高于b组，两者出现了明显不同的分布情况(图4)。a组所得dh在这三个性状上的变异范围分别为110.23-162.61cm,38.50-50.03cm和13-19，而b组所得dh在这三个性状上的变异范围分别为87.18-151.35cm，36.37-46.10cm和10-17，比较最终平均值发现，在目标性状上均存在显著的差异(p《0.05)，其中所得dh平均穗长相差14.27mm，穗粗相差2.77mm，穗行数差异达到2.22(表3)。由此说明，对杂交诱导当代果穗关键性状进行选择，可有效提高dh系在目标性状方面的表现，也证明了诱选结合在果穗性状选择中的有效性。
[0063]
表3、杂交诱导当代不同果穗性状筛选所得dh表现
[0064][0065]
注：同一项目内，不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。
[0066]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。