M2型巨噬细胞外泌体在治疗骨质疏松症药物制备中的应用

m2型巨噬细胞外泌体在治疗骨质疏松症药物制备中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及巨噬细胞来源的外泌体的新应用，其中具体涉及一种m2巨噬细胞来源的外泌体在骨质疏松中的应用。


背景技术：

2.骨质疏松症(op)是一种系统性骨骼疾病，其特征是骨量低和骨组织微结构破坏，从而导致骨脆性增加和骨折易感性。随着人口老龄化的增长，骨质疏松症已成为最常见的骨骼疾病之一。成骨细胞和破骨细胞的功能失调是骨质疏松症的主要原因。研究表明，巨噬细胞极化改变可以减少骨吸收因子，促进骨生成以及骨矿化。
3.巨噬细胞是一种具有高度异质性和可塑性的细胞，可根据不同刺激和微环境，在体内分化为不同类型。其中未被激活巨噬细胞(m0)，可通过脂多糖(lps)和/或干扰素-γ(ifn-γ)激活为促炎性巨噬细胞表型(m1)，产生高水平的诱导型一氧化氮合酶(inos)、前列腺素e2(pge2)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、il-1β和il-6，启动免疫反应，清除病原体和肿瘤细胞。或者被白细胞介素-4(il-4)、il-13或il-10激活分化形成抗炎型巨噬细胞，(m2)表型，可表达高水平的精氨酸酶1(arg1)、il-4、il-10、il-1ra、巨噬细胞甘露醇受体(cd206)、转化生长因子β(tgf-β)和血管内皮生长因子(vegf)等，在组织修复和新生血管形成中起核心作用。但由于异体细胞的免疫原性等原因，其应用备受限制。
4.而细胞外泌体作为一种新型的细胞通讯介质，因其独特的优势而受到越来越多的关注。外泌体是直径为30～150nm的小囊泡和脂质双层。通过细胞胞吐释放后，细胞外囊泡与靶细胞的表面受体相互作用，并通过内吞作用将细胞内成分(包括蛋白质、脂质、mrnas和mirna)运输到靶细胞的胞质溶胶。细胞外囊泡还可以介导分泌细胞和细胞外基质之间的级联信号，并作为细胞外基质中邻近细胞的间接通讯。此外，细胞外囊泡可以释放到血液或淋巴管中，与靶细胞进行远距离通信。它们通过复杂的基因调控网络参与许多生物过程，但不受受体与配体结合的限制。细胞外囊泡被认为是传递mirna的主要途径，同时也参与蛋白质的转运。由于其依赖于多样化的监管模式、高吸收效率、易用性和灵活性，最近受到越来越多的关注。


技术实现要素：

5.本发明的目的是要提供一种巨m2型巨噬细胞外泌体在治疗骨质疏松症药物制备中的应用。
6.本发明采用的技术方案具体如下：
7.一种m2型巨噬细胞外泌体在治疗骨质疏松症药物制备中的应用。
8.进一步地，所述m2巨噬细胞外泌体为可以靶向破骨细胞前体的，由m2巨噬细胞所分泌的一种囊泡。
9.进一步地，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症。
10.进一步地，所述药物为注射剂、片剂、胶囊剂、粉末剂等。其中，注射剂将提取的新
鲜外泌体以磷酸缓冲盐溶液为溶剂制备。
11.进一步地，可将外泌体冻干之后制备成片剂、胶囊剂、粉末剂。
12.本发明的有益效果是，本发明通过制备m2巨噬细胞来源的外泌体，在细胞水平通过rt-qpcr、wb、免疫荧光、trap染色明确m2-evs能够有效抑制破骨细胞形成及骨吸收能力，在动物体内可证实m2-evs可有效抑制ovx小鼠的骨质流失情况。
附图说明
13.图1为m2巨噬细胞的诱导结果图，其中，a为光学显微镜图(放大倍数20)，b为精氨酸(arginase-1)和甘露醇受体(mannose receptor)rt-qpcr检测结果图；
14.图2为m2巨噬细胞来源外泌体的鉴定结果图，其中，a为光学显微镜图(比例尺是0.2微米)，b为纳米粒子追踪分的结果图；
15.图3为破骨细胞的诱导7天后结果图(放大倍数10)，其中，左为明场，右为trap染色之后；
16.图4为m2-evs对破骨细胞融合的抑制结果图，其中a为光学显微镜图(上为明场，下为trap染色之后，放大倍数10)，b和c分别为破骨细胞前体(ocp)、rankl诱导的破骨细胞(ocp+rankl)和m2-evs处理后破骨细胞(ocp+rankl+m2-evs)的蛋白检测结果和蛋白表达统计图；
17.图5为假手术组(sham)、ovx小鼠组(ovx)和m2-evs处理组(m2-evs)的micro ct图。
具体实施方式
18.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。
19.实施例1、m2巨噬细胞外泌体的分离及鉴定
20.s1.m2巨噬细胞的诱导
21.raw264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)培养于含有10％胎牛血清的dmem高糖培养基的10cm皿中，待细胞增殖接近70～80％融合时，传代于10cm皿中，培养基为不含胎牛血清的dmem高糖培养基，隔天进行予以10ng/ml的il-4刺激，诱导24小时。图1显示：il-4刺激后，细胞形态为“纺锤形”，rt-qpcr检测显示，细胞可以表达m2巨噬细胞经典标记物：精氨酸(arg-1)和甘露醇受体(mannose receptor)。确定诱导出细胞为m2型巨噬细胞后，收集该细胞上清用于后续实验。
22.s2.m2-evs分离
23.将上述收集的上清进行外泌体提取。具体方法有以下3种：
24.1.梯度离心法：离心(4℃，300
×
g，10分钟)，取上清后再次离心(4℃，2000
×
g，10分钟)，再次取上清进行离心(4℃，10000
×
g，30分钟)，弃去沉淀，将上清于4℃中120,000
×
g离心70分钟，收集沉淀用pbs重悬后，再次离心(4℃，120，000
×
g，70分钟)，取沉淀获得m2巨噬细胞外泌体。
25.2.试剂盒提取法，采用市场的试剂盒如(total exosome isolation reagent(no.4478359,invitrogen)按照试剂盒要求提取。
26.3.采用尺寸排除色谱法提取外泌体。
27.s3.m2-evs鉴定
28.通过nta法(nanoparticle tracking analysis)分析其粒径，透射电镜观察其表面形态为典型的双凹圆盘状，如图2所示，颗粒的半径在50-200nm之间，符合外泌体的半径要求。表明提取出的囊泡是外泌体(m2-ev)。
29.实施例2、m2-evs对破骨细胞的抑制作用
30.s1.小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmm)的分离
31.小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmm)按常规方法分离，分离后bmm培养于含有10％胎牛血清，30ng/ml mcsf,青霉素链霉素双抗的alpha mem高糖培养基的10cm皿中，隔2天换液，诱导第5天时，细胞可增殖到70％融合度，收集细胞用于后续实验。
32.s2.破骨细胞的诱导
33.将上述细胞消化种于96孔板中，每孔铺入100,00个bmms，培养基同上述，隔天加入rankl至终浓度为100ng/ml，隔2天换液。图3显示，诱导后，细胞在4天左右细胞开始融合，第6、7天可出现大量的融合破骨细胞。
34.s3.m2-evs对破骨细胞的抑制作用
35.设置ocp+rankl组：将100,00个bmms接种于同上述培养基中，隔天加入rankl至终浓度为50ng/ml，隔2天换液直至7天收样；
36.设置ocp+rankl+m2-evs组：将100,00个bmms接种于同上述培养基中，隔天加入rankl至终浓度为100ng/ml，隔2天换液的同时加入m2-evs至终浓度为100ug/ml直至7天收样；所有组别均通过rt-qpcr、wb、免疫荧光、trap染色确定破骨细胞的形成情况。图4结果显示，加入m2-evs的破骨细胞融合明显受抑制，且体外增殖实验结果显示细胞增殖能力未受明显影响。
37.实施例3、m2-evs对骨质疏松小鼠的挽救作用
38.对8周的雌性小鼠进行常规的卵巢摘除手术得到卵巢切除术(ovx)小鼠，1周以后通过尾静脉注射1ug/ul的m2-evs100ul(溶剂为10％pbs缓冲液)，每周注射2次。注射8周后，micro ct分析定期注射了m2-evs的ovx小鼠和注射溶剂对照组(磷酸缓冲盐溶液)股骨骨质形成情况。图5结果显示加入m2-evs可有效改善ovx小鼠的骨质流失情况。
39.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。