一种利用DNA分子标记快速区分柱型苹果苗木的方法与流程

本发明涉及一种利用DNA分子标记快速区分柱型苹果苗木的方法，属于分子遗传育种技术领域。

背景技术：
：

柱型苹果(Columnar apple)具有节间短，腋芽萌发为大量的短枝，很少或无侧生延长新梢的特点，呈自然单干形，既不同于普通型，也不同于一般的短枝型或矮化型。这种树型紧凑、修剪量极轻，非常适合高度密植和机械化管理。推广该树型将会极大节约劳动力和生产成本，符合苹果省力化栽培的发展要求。研究表明，苹果柱型性状是受显性单基因(Co)控制的质量性状。所以，柱型苹果是果树株型育种的理想遗传资源。但柱型苹果与普通型苹果在幼苗期不易区分，形态学鉴定只能等其生长到一定程度，依靠树形以及外部形态进行区分，耗时较长，费时费力。

随着遗传学和分子生物学的发展，人们认识到利用遗传标记进行辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)，可以极大地提高选择效率，减少育种过程的盲目性。标记育种(Marker breeding)是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项技术。它是利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行间接选择，是对目标性状在分子水平的选择，不受环境影响，选择结果可靠；在聚合有利目标性状的同时，可以在回交渐渗过程中，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，加速育种进程。与育种有关的遗传标记主要有四种类型：形态学标记(Morphological Markers)、细胞学标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Molecular Markers)。

近年来，分子生物学的发展为植物遗传育种提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。与其它标记相比，DNA分子标记有以下几个主要特点：一是能对各个发育时期的个体、器官，甚至细胞作检测，不受环境与基因表达与否限制；二是数量极多，遍及整个基因组；三是多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；四是表现为中性，即不影响目标性状表达，与不良性状无必然联系；五是许多标记为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。

技术实现要素：
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本发明的目的在于克服1-2年生柱型苹果杂种苗以及柱型苹果品种幼苗期在形态学上不易辨别和区分的缺陷，提供一种利用DNA分子标记快速区分柱型苹果苗木的方法，即一种与控制苹果柱型基因Co紧密连锁的DNA分子标记，利用PCR技术检测该分子标记的方法。

为了实现上述发明目的，用本发明的2对引物在柱型苹果杂交后代分离群体中的柱型和普通型个体以及柱型和普通型苹果品种进行验证标记的有效性。以引物对Co1进行PCR扩增能在柱型苹果中扩增出一条585bp的DNA特异片段；使用Co2引物对进行PCR扩增，能在柱型苹果中扩增出一条319bp的DNA特异片段；引物对Co1、引物对Co2在普通型苹果中均扩增不出任何条带。通过利用该分子标记对苹果柱型性状进行检测，以期对杂交后代的1年生幼苗进行有目的地选择，及早淘汰非目标性状，大大提高育种效率，利用本发明也可以提高鉴别幼苗期柱型苹果品种的准确性，为柱型苹果苗木的生产、销售提供技术指导。

本发明所提供的用于鉴定区分柱型苹果和普通型的分子标记引物对Co1、Co2，Co1和Co2两对引物在柱型苹果中至少能扩增出1条特异性条带，在普通型苹果中2对引物均扩增不出条带，其中，引物对Co1的脱氧核糖核苷酸序列为：

上游引物Co1-F：GATGCGAGAATTAACTAGCACAC

下游引物Co1-R：GAATTGTTGTATGCGTTTTTCC

使用该引物进行PCR扩增，仅能在柱型苹果中扩增出一条585bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：

GATGCGAGAATTAACTAGCACACAAATTAAACCCTCTTTTTGTCAATTGTAGTATAAGTATAAGTAGGGTATCGTTCTAGGCCGGGGATTAGGAGGGCTTGCTAAAACCTCTTAAAAACATAAAAACAAAGTTAAAAATATTAAACAAGACTCAAGGACACAAAACTAGGCTAAAAACTCTAATAATTCGAAACACACTTAAAATGACTCAAAATAATAAAAACAATCAAAATAGACACTAGGAATTGAATGGACGGAAATTAAATTAAAAGACTAACAATAAAGAAAACTAACTAAATAATATAATTTAATAATGGGTGGGTGTTTGGTTTGATGAAAAGTAAATTAAACTTAATTAAATTACAGAATTGACAAAAACATAAAATTAAGGTGAAAGGATAAATGACGGACTAGCTAGAGGGTTCTTCTCCACACATGACACATATGCAACCTAAATTGATTTTCAGTTGTTCTTTCAATAAATTGTGAATCTCAATACTCCAGATTAACCGTGAACAGCACTTTTTTAATCTTCAAGTTTTCCTTAAGTTATTGAATTGGACGGAAAAACGCATACAACAATTC

引物对Co2的脱氧核糖核苷酸序列为：

Co2-F：TCTACTCCTCTTTTGCCTTGG

Co2-R:ACTTCGAATTCACTCGTCTTT

使用该引物进行PCR扩增，仅能在柱型苹果中扩增出一条319bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列如下列SEQ ID NO:2所示：

TCTACTCCTCTTTTGCCTTGGATTCTTTCCTTTCTTTGTCCAACTCTTTCTTTCCACCGTTTTCTTTCTTTTTTTTTTCTACAAAACAAAACCATCATGATGATGTTTCAAACATCATCACGACTTATCATTATTAAATATAATTTTTAATTTAATTTAAAAGCTGATCTACACAGACAGTTTTGACGAATTTATTACATAAAATTTCACTTGTTCTATTTTTATTTTCTTTGCATAACAAATCCTATAAACACAAAAATAACGTAAATAGCTCAAAAATATAAGGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGAATTCGAAGT

本发明方法按照如下步骤操作：

一、采用CTAB法提取苹果基因组DNA

1、取2ml离心管，加入1.2ml CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和50μLβ-巯基乙醇，并于65℃水浴锅中预热，取0.5g左右幼嫩的苹果叶片，加入液氮快速研磨成细粉，转入上述装有CTAB的离心管中，震荡混匀，置于65℃水浴锅中水浴30min，期间多次颠倒混匀；

2、取出冷却至室温，加入氯仿，轻轻颠倒混匀，静止，4℃，12000rpm离心，取1000μL上清液至新的2ml离心管中；

3、加入上清液1/2体积的Tris(三羟甲基氨基甲烷)饱和酚，颠倒混匀，静止，再加入上清液1/2体积的氯仿，颠倒混匀，静止，4℃，12000rpm离心，取800μL上清液至新的2ml离心管中；

4、加入氯仿，颠倒混匀，静止，4℃，12000rpm离心，取600μL上清液至新的1.5ml离心管中；

5、加入上清液1/10的无水乙醇和1/20的醋酸钠，-20℃静止30min，4℃，12000rpm离心，将上清移到新的1.5ml的离心管中；

6、加入等体积的异丙醇，-20℃静止2小时，4℃，12000rpm离心，弃上清，保留沉淀；

7、加入1ml 75％的无水乙醇清洗沉淀一次，然后利用无水乙醇清洗一次，待酒精挥发干后，加入50μL无菌的双蒸水(Distillation-Distillation H₂O，ddH₂O)溶解，取5μLDNA利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量；

二、PCR扩增

首先利用苹果管家基因MdActin引物以提取的苹果DNA为模版进行PCR扩增，以检测DNA的质量，排除因DNA的原因引起的试验误差，然后再利用引物对Co1和Co2以提取的苹果DNA为模版进行PCR扩增，所用苹果MdActin基因的引物序列为：

MdActin-F:AAGATTTGGCATCACACGTTC

MdActin-R:TGGATGGCAACATACATAGCA

PCR反应采用12μL体系：

PCR反应程序：

三、对扩增产物进行电泳检测

PCR反应结束后，即将产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，检查不同待测样品DNA PCR反应中产生的DNA条带；

其中，所述引物对Co1的脱氧核糖核苷酸序列为：

上游引物Co1-F：GATGCGAGAATTAACTAGCACAC

下游引物Co1-R：GAATTGTTGTATGCGTTTTTCC

使用该引物进行PCR扩增，仅能在柱型苹果中扩增出一条585bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：

GATGCGAGAATTAACTAGCACACAAATTAAACCCTCTTTTTGTCAATTGTAGTATAAGTATAAGTAGGGTATCGTTCTAGGCCGGGGATTAGGAGGGCTTGCTAAAACCTCTTAAAAACATAAAAACAAAGTTAAAAATATTAAACAAGACTCAAGGACACAAAACTAGGCTAAAAACTCTAATAATTCGAAACACACTTAAAATGACTCAAAATAATAAAAACAATCAAAATAGACACTAGGAATTGAATGGACGGAAATTAAATTAAAAGACTAACAATAAAGAAAACTAACTAAATAATATAATTTAATAATGGGTGGGTGTTTGGTTTGATGAAAAGTAAATTAAACTTAATTAAATTACAGAATTGACAAAAACATAAAATTAAGGTGAAAGGATAAATGACGGACTAGCTAGAGGGTTCTTCTCCACACATGACACATATGCAACCTAAATTGATTTTCAGTTGTTCTTTCAATAAATTGTGAATCTCAATACTCCAGATTAACCGTGAACAGCACTTTTTTAATCTTCAAGTTTTCCTTAAGTTATTGAATTGGACGGAAAAACGCATACAACAATTC

所述引物对Co2的脱氧核糖核苷酸序列为：

Co2-F：TCTACTCCTCTTTTGCCTTGG

Co2-R:ACTTCGAATTCACTCGTCTTT

使用该引物进行PCR扩增，仅能在柱型苹果中扩增出一条319bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列如下列SEQ ID NO:2所示：

TCTACTCCTCTTTTGCCTTGGATTCTTTCCTTTCTTTGTCCAACTCTTTCTTTCCACCGTTTTCTTTCTTTTTTTTTTCTACAAAACAAAACCATCATGATGATGTTTCAAACATCATCACGACTTATCATTATTAAATATAATTTTTAATTTAATTTAAAAGCTGATCTACACAGACAGTTTTGACGAATTTATTACATAAAATTTCACTTGTTCTATTTTTATTTTCTTTGCATAACAAATCCTATAAACACAAAAATAACGTAAATAGCTCAAAAATATAAGGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGAATTCGAAGT

PCR结果显示：用Co1和Co2引物对在柱型苹果能扩增出DNA特异性条带，而在普通型苹果中扩增不出DNA特异性条带。

本发明方法以待检测的苹果叶片DNA为模版，以两对寡聚脱氧核糖核苷酸序列Co1和Co2作为引物对，同时对与柱型基因相连锁的DNA分子标记进行PCR反应扩增，对扩增产物进行电泳检测，2对引物的扩增产物电泳结果中至少1对引物有所述DNA分子标记对应的DNA特异条带，则说明对应的苹果苗木为柱型苹果；2对引物的扩增产物电泳结果均无对应的DNA特异条带，则为普通型苹果。

本发明方法对柱型苹果材料辨识率可达到88％；对普通型苹果材料辨识率达到100％。

利用DNA分子标记，在苗期可以有效地进行早期辅助选择，及早淘汰非目标个体。本发明方法以苹果叶片为试材，利用本发明公开的分子标记引物，可在幼苗期对杂交后代的苹果苗进行分子标记辅助选择，避免了幼苗期形态学不容易鉴定的缺陷，可大大提高育种效率，加速育种进程。同时，可以简单快捷地辨别柱型和普通型苹果苗木，方便、快速、准确地区分出1-2年生苹果苗木中的柱型类型，避免了假苗木带来的纠纷。

附图说明：

图1为56个试材利用MdActin引物对扩增产物条带特征图；

图2为25个柱型苹果中Co1和Co2引物对扩增产物条带特征图；

图3为31个普通型苹果中Co1和Co2引物对扩增产物条带特征图。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例对本发明方法做进一步阐述。

实施例1、

本实施例以保存在青岛农业大学胶州农业科技示范园的25个柱型苹果类型和31个普通型苹果类型为试材，25个柱型类型包括‘富士’苹果与柱型苹果杂交F1代群体的23个柱型杂种个体、2个柱型苹果品种‘鲁加4号’和‘威塞克旭’；31个普通型苹果类型包括‘富士’苹果与柱型苹果杂交F1代群体的29个普通型杂种个体、2个普通型品种‘富士’和‘旭’。

具体操作步骤如下：

一、采用CTAB法提取苹果基因组DNA

1、取2ml的离心管，加入1.2ml CTAB和50μLβ-巯基乙醇，并于65℃水浴锅中预热，取0.5g左右幼嫩的苹果叶片，加入液氮快速研磨成细粉，转入上述装有CTAB的离心管中，震荡混匀，置于65℃水浴锅中水浴30min，期间多次颠倒混匀；

2、取出冷却至室温，加入700μL氯仿，轻轻颠倒混匀，静止5min，4℃，12000rpm离心15min，取1000μL上清液至新的2ml离心管中；

3、加入上清液1/2体积的Tris饱和酚，颠倒混匀，静止5min，再加入上清液1/2体积的氯仿，颠倒混匀，静止5min，4℃，12000rpm离心15min，取800μL上清液至新的2ml离心管中；

4、加入800μL氯仿，颠倒混匀，静止5min，4℃，12000rpm离心15min，取600μL上清液至新的1.5ml离心管中；

5、加入上清液1/10的无水乙醇和1/20的醋酸钠，-20℃静止30min，4℃，12000rpm离心15min，将上清移到新的1.5ml的离心管中；

6、加入等体积的异丙醇，-20℃静止2小时，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，保留沉淀；

7、加入1ml 75％的无水乙醇清洗沉淀一次，然后利用无水乙醇清洗一次，待酒精挥发干后，加入50μL无菌的ddH₂O溶解。取5μLDNA利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量；

二、PCR扩增：

首先利用苹果管家基因MdActin引物以提取的苹果DNA为模版进行PCR扩增，以检测DNA的质量，排除因DNA的原因引起的试验误差，然后再利用引物对Co1和Co2以提取的苹果DNA为模版进行PCR扩增，所用苹果MdActin基因的引物序列为：

MdActin-F:AAGATTTGGCATCACACGTTC

MdActin-R:TGGATGGCAACATACATAGCA

PCR反应采用12μL体系：

PCR反应程序：

三、对扩增产物进行电泳检测

PCR反应结束后，即将产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，检查不同待测样品DNA PCR反应中产生的DNA条带。

其中，所述引物对Co1的脱氧核糖核苷酸序列为：

上游引物Co1-F：GATGCGAGAATTAACTAGCACAC

下游引物Co1-R：GAATTGTTGTATGCGTTTTTCC

使用该引物进行PCR扩增，仅能在柱型苹果中扩增出一条585bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：

GATGCGAGAATTAACTAGCACACAAATTAAACCCTCTTTTTGTCAATTGTAGTATAAGTATAAGTAGGGTATCGTTCTAGGCCGGGGATTAGGAGGGCTTGCTAAAACCTCTTAAAAACATAAAAACAAAGTTAAAAATATTAAACAAGACTCAAGGACACAAAACTAGGCTAAAAACTCTAATAATTCGAAACACACTTAAAATGACTCAAAATAATAAAAACAATCAAAATAGACACTAGGAATTGAATGGACGGAAATTAAATTAAAAGACTAACAATAAAGAAAACTAACTAAATAATATAATTTAATAATGGGTGGGTGTTTGGTTTGATGAAAAGTAAATTAAACTTAATTAAATTACAGAATTGACAAAAACATAAAATTAAGGTGAAAGGATAAATGACGGACTAGCTAGAGGGTTCTTCTCCACACATGACACATATGCAACCTAAATTGATTTTCAGTTGTTCTTTCAATAAATTGTGAATCTCAATACTCCAGATTAACCGTGAACAGCACTTTTTTAATCTTCAAGTTTTCCTTAAGTTATTGAATTGGACGGAAAAACGCATACAACAATTC

所述引物对Co2的脱氧核糖核苷酸序列为：

Co2-F：TCTACTCCTCTTTTGCCTTGG

Co2-R:ACTTCGAATTCACTCGTCTTT

使用该引物进行PCR扩增，仅能在柱型苹果中扩增出一条319bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列如下列SEQ ID NO:2所示：

TCTACTCCTCTTTTGCCTTGGATTCTTTCCTTTCTTTGTCCAACTCTTTCTTTCCACCGTTTTCTTTCTTTTTTTTTTCTACAAAACAAAACCATCATGATGATGTTTCAAACATCATCACGACTTATCATTATTAAATATAATTTTTAATTTAATTTAAAAGCTGATCTACACAGACAGTTTTGACGAATTTATTACATAAAATTTCACTTGTTCTATTTTTATTTTCTTTGCATAACAAATCCTATAAACACAAAAATAACGTAAATAGCTCAAAAATATAAGGAACTAACTAAGAAAAGACGAGTGAATTCGAAGT

本发明方法首先利用苹果管家基因MdActin引物对56个试材进行PCR扩增，结果显示所有试材都能够扩增出目的条带，说明所提取的DNA可以用于后续实验，如图1所示，图1中，M：DNA maker；1-23：杂种F1代中柱型苹果；24：柱型苹果‘鲁加4号’，25:柱型苹果‘威塞克旭’；26-54杂种F1代中普通型苹果；55:普通型苹果‘富士’；56:普通型苹果‘旭’；然后利用引物对Co1和Co2对56个试材进行PCR扩增。若待检测DNA的泳道有Co1引物对585bp或Co2引物对的319bp的DNA特异性条带，则能够判断本样品属于柱型苹果，若没有Co1和Co2引物对所对应的DNA特异性条带，则能够判断本样品属于普通型苹果。结果显示23个柱型杂种F1代中只有3个材料利用Co1和Co2引物对没能扩增出相应的特异性条带，如图2所示，图2中，M：DNA maker；1-23：杂种F1代中柱型苹果；24：柱型苹果‘鲁加4号’，25:柱型苹果‘威塞克旭’；A为引物对Co1的扩增产物条带；B为引物对Co2的扩增产物条带。29个普通型杂种F1代都不能够利用Co1和Co2引物对扩增出相应的特异性条带，如图3所示，图3中，M：DNA maker；1-29：杂种F1代中普通型苹果；30：普通型苹果‘富士’；31：普通型苹果‘旭’。

本实施例还对柱型苹果品种‘威塞克旭’、‘鲁加四号’以及普通型苹果‘旭’和‘富士’进行了检测，PCR结果显示：用Co1和Co2引物对在柱型苹果‘威塞克旭’和‘鲁加四号’中均能扩增出DNA特异性条带，如图2所示；而在普通型苹果‘旭’和‘富士’中扩增不出DNA特异性条带，如图3所示。

本发明方法对25个柱型苹果材料可以辨别22个，辨识率达到88％；对31个普通型苹果材料可以辨别31个，辨识率达到100％。

序列表

SEQ ID NO:1：

GATGCGAGAA TTAACTAGCA CACAAATTAA ACCCTCTTTT TGTCAATTGT AGTATAAGTA 60

TAAGTAGGGT ATCGTTCTAG GCCGGGGATT AGGAGGGCTT GCTAAAACCT CTTAAAAACA 120

TAAAAACAAA GTTAAAAATA TTAAACAAGA CTCAAGGACA CAAAACTAGG CTAAAAACTC 180

TAATAATTCG AAACACACTT AAAATGACTC AAAATAATAA AAACAATCAA AATAGACACT 240

AGGAATTGAA TGGACGGAAA TTAAATTAAA AGACTAACAA TAAAGAAAAC TAACTAAATA 300

ATATAATTTA ATAATGGGTG GGTGTTTGGT TTGATGAAAA GTAAATTAAA CTTAATTAAA 360

TTACAGAATT GACAAAAACA TAAAATTAAG GTGAAAGGAT AAATGACGGA CTAGCTAGAG 420

GGTTCTTCTC CACACATGAC ACATATGCAA CCTAAATTGA TTTTCAGTTG TTCTTTCAAT 480

AAATTGTGAA TCTCAATACT CCAGATTAAC CGTGAACAGC ACTTTTTTAA TCTTCAAGTT 540

TTCCTTAAGT TATTGAATTG GACGGAAAAA CGCATACAAC AATTC 585

SEQ ID NO:2：

TCTACTCCTC TTTTGCCTTG GATTCTTTCC TTTCTTTGTC CAACTCTTTC TTTCCACCGT 60

TTTCTTTCTT TTTTTTTTCT ACAAAACAAA ACCATCATGA TGATGTTTCA AACATCATCA 120

CGACTTATCA TTATTAAATA TAATTTTTAA TTTAATTTAA AAGCTGATCT ACACAGACAG 180

TTTTGACGAA TTTATTACAT AAAATTTCAC TTGTTCTATT TTTATTTTCT TTGCATAACA 240

AATCCTATAA ACACAAAAAT AACGTAAATA GCTCAAAAAT ATAAGGAACT AACTAAGAAA 300

AGACGAGTGA ATTCGAAGT 319