同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法与流程

技术特征：

1.一种同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取玉米幼苗或叶片，剪碎后加入破碎缓冲液，研磨破碎后过滤得匀浆液，再经离心分离，弃上清液得沉淀物；

（2）向步骤（1）所得沉淀物中加入分离缓冲液混匀得到重悬液，再将所述重悬液加至percoll密度梯度分离液的上面，进行梯度离心分离；

（3）分别抽取分离液梯度交界面处的叶绿体和底部沉淀物，再分别加入纯化缓冲液进行离心纯化分离，去上清液得对应的叶绿体和细胞核。

2.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，以重量份计，所述破碎缓冲液的配制试剂包括：

mops40～45份、nacl28～30份、kcl55～65份、edta6～8份、山梨醇180～185份。

3.根据权利要求2所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，所述破碎缓冲液还包括：

在使用即时加入的精胺0.3～0.5份、亚精胺0.6～0.8份和蔗糖850～860份。

4.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，每研磨破碎3～5s后停顿5～10s，重复3～5次。

5.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，以重量份计，所述分离缓冲液的配制试剂包括：

hepes115～120份、nacl20～25份、kcl55～65份、edta6～8份、抗坏血酸8～10份、精胺0.3～0.5份、亚精胺0.6～0.8份。

6.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述percoll密度梯度分离液包括：

底层为体积分数35%的percoll分离液和上层为体积分数20%的percoll分离液；所述percoll分离液是由percoll和分离缓冲液按对应的体积比配制而成。

7.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（2）或/和步骤（3）中，离心分离的条件为：0～4℃，2000～3000g，离心6～10分钟。

8.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，以重量份计，所述纯化缓冲液的配制试剂包括：

mops40～45份、nacl26～30份、kcl55～65份、edta6～8份。

9.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，所述破碎缓冲液、分离缓冲液、percoll密度梯度分离液或/和纯化缓冲液使用前在冰上预冷。

10.根据权利要求1所述的同时分离提取玉米细胞核和叶绿体的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，研磨破碎采用榨汁机于0～4℃下间隔研磨破碎。

技术总结
本发明公开了一种同时分离提取细胞核和叶绿体的方法，旨在解决现有分离提取方法中无法同时分离出高活性细胞核和叶绿体技术问题，其主要步骤包括：（1）取植株幼苗或叶片，剪碎后加入破碎缓冲液，研磨破碎后过滤得匀浆液，再经离心分离，弃上清液得沉淀物；（2）向上步骤所得沉淀物中加入分离缓冲液混匀得到重悬液，再将所述重悬液加至Percoll密度梯度分离液的上面，进行梯度离心分离；（3）分别抽取分离液梯度交接面处的叶绿体和底部沉淀物，再分别加入纯化缓冲液进行离心纯化分离，去上清液得对应的叶绿体和细胞核。本发明利用不同缓冲液对细胞核和叶绿体的分离提纯，具有操作简便，所得到的纯化后细胞核提取率高达80%，叶绿体的提取率高达90%。

技术研发人员：杨浩;苏磊;尤晨;王亮;李雪;王志飞
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2020.03.06
技术公布日：2020.07.24