一种农杆菌介导桃遗传转化方法

1.本发明涉及园艺作物基因工程领域，尤其涉及一种农杆菌介导桃遗传转化方法。


背景技术：

2.桃(amygdalus persica l.)：蔷薇科、桃属植物，落叶小乔木。桃树原产于中国，早在公元前十世纪已有记载。桃主要栽植在中国、日本等亚洲国家。其种类包括黄桃、水蜜桃、油桃、蟠桃等。
3.桃的童期较长，采用传统的育种技术繁育需要花费较长的时间，这会大大增加劳动力成本，降低土地利用率。而利用基因工程进行种质改良，则可以解决这一问题，极大地缩短育种的时间。
4.分子生物学领域不断进步和发展，果树类园艺作物的遗传转化也在逐步完善。其中，桃的遗传转化起步相对较晚，直到1990年，r.scorza,p.h.morgens,j.m.cordts才用载体pga472和根癌农杆菌a281获得了转基因愈伤组织。然而，此方法的转化效率较低，已不能满足当今需求。
5.据此，目前急需一种转化率更高的农杆菌介导桃遗传转化方法。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于提供一种转化率更高的农杆菌介导桃遗传转化方法。
7.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
8.一种农杆菌介导桃遗传转化方法，包括如下步骤：
9.(1)遗传转化受体建立
10.以桃当年新鲜下胚轴为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面；诱导出的愈伤组织历经继代即可作为遗传转化受体；
11.(2)农杆菌的培养与侵染液的配置
12.将带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101在lb固体培养基上划线活化，挑选单菌落进行菌液pcr；将挑选出的单菌落摇菌14～18h，涂布培养；在液体愈伤分化培养基中添加0.02～0.03％乙酰丁香酮后，再加入上述菌悬浮培养2～3h，即为侵染液；
13.(3)侵染与共培养
14.将步骤(1)得到的愈伤组织浸泡在步骤(2)配置的侵染液中，在25～30℃、50～80r/min的条件下侵染10～20min；取出后用无菌纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分；最后，将其接种在共培养培养基上，暗培养2.5～3.5天；
15.(4)除菌与筛选培养
16.将愈伤组织从共培养培养基中取出，用含400～500mg/l羧苄青霉素carb的无菌水进行清洗；反复清洗2～3遍后，用无菌纱布滤纸吸除水分，再转移到筛选培养基上培养；每20～30天进行一次筛选继代，存活下来的即为抗性愈伤组织；
17.(5)抗性愈伤组织gus染色鉴定
18.将步骤(4)筛选获得的抗性愈伤组织分成两份，其中一份用于gus染色检测，有特异性蓝色显色反应的愈伤组织即认定为阳性愈伤组织，表明桃遗传转化成功；另一份继续用筛选培养基继代，诱导不定芽。
19.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选择花芽分化时期的桃下胚轴为外植体。
20.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+1.0～2.0mg/l 6
‑
ba+0.2～0.6mg/l iba+20g/l蔗糖+6～8g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.6～5.8；诱导愈伤组织生长的条件为：16h光照、8h黑暗的光周期，光强1500～2000lx，温度25℃，无菌。
21.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，还包括洗菌步骤；在得到外植体后，先用洗衣粉水浸泡15～25min，再流水冲洗0.5～1.5h；接着，在超净工作台上将外植体置于75％酒精中浸泡25～35s，无菌水冲洗1～2次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡5～6分钟，其中升汞溶液中加入1～2滴吐温试剂；接着，再用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸将多余水分吸干后，即可水平接种在愈伤组织诱导培养基表面。
22.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，将psak277
‑
gus质粒与农杆菌gv3101进行转化，即可获得带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101。
23.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，液体愈伤分化培养基的配方为：ms+1.0～2.0mg/l 6
‑
ba+0.2～0.6mg/l iba+20g/l蔗糖++0.5g/l mes，ph 5.6～5.8；培养条件为：温度25℃，无菌。
24.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，共培养培养基的配方为：ms+2.0～2.5mg/l tdz+0.5～1.0mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+6～8g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.6～5.8；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
25.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，筛选培养基的配方为：ms+2.0～2.5mg/l tdz+0.5～1.0mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+6～8g/l琼脂+0.5g/l mes+400mg/l kana+400mg/l tim，ph 5.6～5.8；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
26.作为本发明的优选方式之一，所述农杆菌菌株gv3101为可在现有流通市场直接购买得到常规菌株；psak277
‑
gus载体以及psak277
‑
gus质粒的获得参见实施例部分。
27.本发明相比现有技术的优点在于：
28.(1)本发明以愈伤组织为受体，以gus基因为报告基因，通过农杆菌gv3101介导的方法进行桃的遗传转化，获得抗性愈伤组织，历经数次继代，经gus染色确定为阳性愈伤组织；较之以前的方法(转化率最多0.3％)，本发明方法可以显著提升农杆菌介导转化的成功率，转化率达到3％左右，同时此方法可以在桃基因工程、细胞工程、代谢工程以及桃遗传转化体系的建立中得到广泛应用；
29.(2)本发明首先建立起一种以桃当年新生梢下胚轴为外植体诱导出愈伤组织，进而进行遗传转化的方法；桃春季新生梢下胚轴酚类物质含量相对较低，且携带病菌少，愈伤组织诱导率高，能够满足愈伤转化的需求；
30.(3)本发明建立的侵染与共培养条件，可进一步确保转化效率；其中，加入的洗菌环节可以防止农杆菌过度生长导致愈伤组织死亡，也可防止转化的细胞直接接触抗生素而
死亡；先在不含抗生素的培养基上培养再放入筛选培养基上培养可提高愈伤组织成活率。
附图说明
31.图1是实施例1中psak277载体图谱；
32.图2是实施例1中作为实验材料所用的愈伤组织图；
33.图3是实施例1中抗性愈伤组织gus染色图；
34.图4是实施例1中在筛选培养基上生长出的抗性愈伤组织。
具体实施方式
35.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
36.实施例1
37.本实施例的一种农杆菌介导桃遗传转化方法，包括如下步骤：
38.(1)遗传转化受体建立
39.3月份至4月份从大田中剪取桃新生芽的下胚轴作为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面；诱导出的愈伤组织历经继代4次，如图1所示，即可作为遗传转化受体。
40.其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+1.5mg/l 6
‑
ba+0.4mg/l iba +20g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.7；诱导愈伤组织生长的条件为：16h光照、8h黑暗的光周期，光强1750lx，温度25℃，无菌。
41.(2)农杆菌的培养与侵染液的配置
42.将psak277
‑
gus质粒与农杆菌gv3101进行转化，获得带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101。其中，psak277载体的构建图谱如图2所示，本领域技术人员根据图2结合本领域常规技术即可构建psak277载体以及psak277
‑
gus质粒。
43.将带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101在含壮观霉素(spectinomycin)和利福平抗生素(rifampicin)的lb固体培养基上划线活化，28℃过夜培养；
44.挑选单菌落至800μl液体lb中28℃、120r/min小摇培养；当od值达到0.7时进行菌液pcr验证，以确保质粒没有丢失。pcr所用引物为psak277载体上所插入的目的基因克隆引物，pcr条件及体系与常规标准操作一致。
45.将挑选出的单菌落摇菌16h，涂布培养；在液体愈伤分化培养基中添加0.026％乙酰丁香酮后，再加入上述菌悬浮培养2.5h，od值达到2.0，即为侵染液。
46.其中，液体愈伤分化培养基的配方为：ms+1.5mg/l 6
‑
ba+0.4mg/l iba+20g/l蔗糖++0.5g/l mes，ph 5.7；培养条件为：温度25℃，无菌。
47.(3)侵染与共培养
48.将步骤(1)得到的愈伤组织浸泡在步骤(2)配置的侵染液中，在28℃、65r/min的条件下侵染15min；取出后用无菌纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分；最后，将其接种在共培养培养基上，暗培养2天。
49.其中，共培养培养基的配方为：ms+2.3mg/l tdz+0.75mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.7；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
50.(4)除菌与筛选培养
51.在超净工作台中，用镊子将愈伤组织从共培养培养基中取出，用含450mg/l羧苄青霉素(carb)的无菌水进行清洗；反复清洗2遍后，用无菌纱布滤纸吸除水分，再转移到含卡那霉素(kanamycin)、特美汀(timentin)的双抗筛选培养基上培养。
52.每25天进行一次筛选继代；继代三次后，转基因愈伤组织生长相对稳定，生长量增多，此时存活下来的即为抗性愈伤组织，如图3所示。
53.其中，筛选培养基的配方为：ms+2.3mg/l tdz+0.75mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l mes+400mg/l kana+400mg/l tim，ph 5.7；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
54.(5)抗性愈伤组织gus染色鉴定
55.将步骤(4)筛选获得的抗性愈伤组织分成两份。其中一份用于中国瑞泰(北京)生物科技有限公司所售的gus染色试剂盒进行gus染色检测，发生蓝色显色反应的即为阳性愈伤组织，肉眼可直接观察出结果，见图4，表明桃遗传转化成功。另一份继续用筛选培养基继代，诱导不定芽。
56.此外，在本实施例中，为了提高愈伤组织的存活率，所述步骤(1)中，还包括洗菌步骤。在得到外植体后，先用洗衣粉水浸泡20min，再流水冲洗1h；接着，在超净工作台上将外植体置于75％酒精中浸泡30s，无菌水冲洗1次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡5.5分钟，其中升汞溶液中加入1滴吐温试剂；接着，再用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸将多余水分吸干后，即可水平接种在愈伤组织诱导培养基表面。
57.实施例2
58.本实施例的一种农杆菌介导桃遗传转化方法，包括如下步骤：
59.(1)遗传转化受体建立
60.3月份至4月份从大田中剪取桃新生芽的下胚轴作为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面；诱导出的愈伤组织历经继代3次，即可作为遗传转化受体。
61.其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+1.0mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l iba+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.6；诱导愈伤组织生长的条件为：16h光照、8h黑暗的光周期，光强1500lx，温度25℃，无菌。
62.(2)农杆菌的培养与侵染液的配置
63.将psak277
‑
gus质粒与农杆菌gv3101进行转化，获得带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101。其中，psak277载体的构建图谱如图2所示，本领域技术人员根据图2结合本领域常规技术即可构建psak277载体以及psak277
‑
gus质粒。
64.将带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101在含壮观霉素(spectinomycin)和利福平抗生素(rifampicin)的lb固体培养基上划线活化，28℃过夜培养；
65.挑选单菌落至800μl液体lb中28℃、120r/min小摇培养；当od值达到0.6时进行菌液pcr验证，以确保质粒没有丢失。pcr所用引物为psak277载体上所插入的目的基因克隆引物，pcr条件及体系与常规标准操作一致。
66.将挑选出的单菌落摇菌14h，涂布培养；在液体愈伤分化培养基中添加0.02％乙酰丁香酮后，再加入上述菌悬浮培养2h，od值达到1.5，即为侵染液。
67.其中，液体愈伤分化培养基的配方为：ms+1.0mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l iba+20g/l蔗糖
++0.5g/l mes，ph 5.6；培养条件为：温度25℃，无菌。
68.(3)侵染与共培养
69.将步骤(1)得到的愈伤组织浸泡在步骤(2)配置的侵染液中，在25℃、50r/min的条件下侵染10min；取出后用无菌纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分；最后，将其接种在共培养培养基上，暗培养2.5天。
70.其中，共培养培养基的配方为：ms+2.0mg/l tdz+0.5mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.6；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
71.(4)除菌与筛选培养
72.在超净工作台中，用镊子将愈伤组织从共培养培养基中取出，用含400mg/l羧苄青霉素(carb)的无菌水进行清洗；反复清洗2遍后，用无菌纱布滤纸吸除水分，再转移到含卡那霉素(kanamycin)、特美汀(timentin)的双抗筛选培养基上培养。
73.每20天进行一次筛选继代；继代三次后，转基因愈伤组织生长相对稳定，生长量增多，此时存活下来的即为抗性愈伤组织。
74.其中，筛选培养基的配方为：ms+2.0mg/l tdz+0.5mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.5g/l mes+400mg/l kana+400mg/l tim，ph 5.6；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
75.(5)抗性愈伤组织gus染色鉴定
76.将步骤(4)筛选获得的抗性愈伤组织分成两份。其中一份用于中国瑞泰(北京)生物科技有限公司所售的gus染色试剂盒进行gus染色检测，发生蓝色显色反应的即为阳性愈伤组织，表明桃遗传转化成功。另一份继续用筛选培养基继代，诱导不定芽。
77.此外，在本实施例中，为了提高愈伤组织的存活率，所述步骤(1)中，还包括洗菌步骤。在得到外植体后，先用洗衣粉水浸泡15min，再流水冲洗0.5h；接着，在超净工作台上将外植体置于75％酒精中浸泡25s，无菌水冲洗1次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡5分钟，其中升汞溶液中加入1滴吐温试剂；接着，再用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸将多余水分吸干后，即可水平接种在愈伤组织诱导培养基表面。
78.实施例3
79.本实施例的一种农杆菌介导桃遗传转化方法，包括如下步骤：
80.(1)遗传转化受体建立
81.3月份至4月份从大田中剪取桃新生芽的下胚轴作为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面；诱导出的愈伤组织历经继代5次，即可作为遗传转化受体。
82.其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+2.0mg/l 6
‑
ba+0.6mg/l iba+20g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.8；诱导愈伤组织生长的条件为：16h光照、8h黑暗的光周期，光强2000lx，温度25℃，无菌。
83.(2)农杆菌的培养与侵染液的配置
84.将psak277
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gus质粒与农杆菌gv3101进行转化，获得带有psak277
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gus质粒的农杆菌gv3101。其中，psak277载体的构建图谱如图2所示，本领域技术人员根据图2结合本领域常规技术即可构建psak277载体以及psak277
‑
gus质粒。
85.将带有psak277
‑
gus质粒的农杆菌gv3101在含壮观霉素(spectinomycin)和利福平抗生素(rifampicin)的lb固体培养基上划线活化，28℃过夜培养；
86.挑选单菌落至800μl液体lb中28℃、120r/min小摇培养；当od值达到0.8时进行菌液pcr验证，以确保质粒没有丢失。pcr所用引物为psak277载体上所插入的目的基因克隆引物，pcr条件及体系与常规标准操作一致。
87.将挑选出的单菌落摇菌18h，涂布培养；在液体愈伤分化培养基中添加0.03％乙酰丁香酮后，再加入上述菌悬浮培养3h，od值达到3.0，即为侵染液。
88.其中，液体愈伤分化培养基的配方为：ms+2.0mg/l 6
‑
ba+0.6mg/l iba+20g/l蔗糖++0.5g/l mes，ph 5.8；培养条件为：温度25℃，无菌。
89.(3)侵染与共培养
90.将步骤(1)得到的愈伤组织浸泡在步骤(2)配置的侵染液中，在30℃、80r/min的条件下侵染20min；取出后用无菌纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分；最后，将其接种在共培养培养基上，暗培养3.5天。
91.其中，共培养培养基的配方为：ms+2.5mg/l tdz+1.0mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.5g/l mes，ph 5.8；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
92.(4)除菌与筛选培养
93.在超净工作台中，用镊子将愈伤组织从共培养培养基中取出，用含500mg/l羧苄青霉素(carb)的无菌水进行清洗；反复清洗3遍后，用无菌纱布滤纸吸除水分，再转移到含卡那霉素(kanamycin)、特美汀(timentin)的双抗筛选培养基上培养。
94.每30天进行一次筛选继代；继代三次后，转基因愈伤组织生长相对稳定，生长量增多，此时存活下来的即为抗性愈伤组织。
95.其中，筛选培养基的配方为：ms+2.5mg/l tdz+1.0mg/l 2,4
‑
d+20g/l蔗糖+8g/l琼脂+0.5g/l mes+400mg/l kana+400mg/l tim，ph 5.8；培养条件为：温度25℃，暗培养，无菌。
96.(5)抗性愈伤组织gus染色鉴定
97.将步骤(4)筛选获得的抗性愈伤组织分成两份。其中一份用于中国瑞泰(北京)生物科技有限公司所售的gus染色试剂盒进行gus染色检测，发生蓝色显色反应的即为阳性愈伤组织，表明桃遗传转化成功。另一份继续用筛选培养基继代，诱导不定芽。
98.此外，在本实施例中，为了提高愈伤组织的存活率，所述步骤(1)中，还包括洗菌步骤。在得到外植体后，先用洗衣粉水浸泡25min，再流水冲洗1.5h；接着，在超净工作台上将外植体置于75％酒精中浸泡35s，无菌水冲洗2次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡6分钟，其中升汞溶液中加入2滴吐温试剂；接着，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸将多余水分吸干后，即可水平接种在愈伤组织诱导培养基表面。
99.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。