一种永生化人喉环后区细胞及其构建方法

1.本发明公开公开一种永生化细胞及其构建方法，尤其是一种人喉腔环后区来源的永生化细胞及其构建方法。


背景技术：

2.随着社会飞速发展，人们的生活水平不断提高，对医疗需求日益增长。咽喉良恶性疾病在临床上非常常见，严重影响患者的生存质量及身心健康，已然成为一个不容忽视的健康及社会问题。然而，临床上对咽喉良恶性疾病的诊断和治疗仍然相当棘手，其根源在于对致病机制的研究不足，因此深入研究分子病理机制尤为重要。但是，由于目前市场上无商品化喉粘膜上皮细胞株购买，需要体外进行正常喉粘膜上皮原代细胞培养，以建立可供研究的喉上皮细胞，为全面探讨不同致病因素在喉部的炎性和恶性疾病中的作用机制研究提供体外模型。
3.由于咽喉部粘膜属于人体终末分化组织，因此细胞增殖能力差，分离出来的细胞脆弱，不易成活。并且由于喉腔的条件限制，获取的组织量少，不能像其他如胃、肠、乳腺等部位组织，可以取大量的组织作为培养原料，若要进行后续大量实验需多次取材，可能导致实验的重复性差。因此喉上皮原代细胞培养存在着许多主观和客观的困难因素，大大限制了喉上皮原代细胞培养的进程。李东军及柯朝阳等人用组织块培养方法对胎儿喉上皮组织进行培养，成功培养出喉上皮原代细胞，但培养方式取材大多取自引产或死产的胎儿喉粘膜组织，由于是胎儿粘膜，喉部粘膜刚分化完成，组织活性高，可提高培养成功率。然而胎儿喉组织来源有限，取材过程复杂。并且原代培养的过程复杂，所需培养时间长，需要耗费大量研究人员的精神与体力，而且费用昂贵。加上原代细胞受到体外有限寿命的限制，刚开始培养出来的细胞可以生长良好，但继续传代至4代左右时，原代细胞出现老化细胞数目增多，细胞增殖缓慢，死亡细胞数目增多。衰老细胞的出现除了影响细胞增殖，延慢实验进度，还会出现众多分子生物学基因的改变，影响实验结果。因此，本技术发明人希望构建能稳定持续传代的喉上皮永生化细胞株，建立理想的细胞模型，为咽喉良恶性疾病发病机制研究奠定基础。
4.最早两个永生化喉上皮细胞是通过外源性导入人乳头状瘤病毒(hpv)e6/e7或猴病毒40(sv40)病毒癌基因而建立的。然而外源性病毒癌基因的直接作用和产生非整倍体细胞的间接作用可影响细胞行为，如有限的分化能力和类似于原位癌的异常改变。因此，亟需构建永生化喉上皮细胞株，为全面探讨咽喉良恶性疾病致病机制研究提供可靠稳定的细胞模型。
5.人的喉腔分为不同的部分，有声带、室带、环后、会厌、声门下。不同结构的上皮存在两种不同类型的粘膜上皮：声带、环后区及下咽上皮以非角化的复层鳞状上皮为主，细胞主要成分是角质形成细胞，声门下、会厌区域由假复层纤毛柱状上皮向鳞状上皮过度，细胞主要成分是柱状细胞。鳞状上皮较柱状上皮排列更为紧密，而且能脱落角质层，对侵袭物质起到抵御作用，因此一般情况下柱状上皮比鳞状上皮更容易受到外源侵袭物损伤，容易出
现声门下狭窄。另外，喉部不同解剖区域由于胚胎来源不同，其分子成分及组织构成不同，对外源性刺激(如病毒、烟酒、胃肠反流物)的抵御能力也不尽相同。如乳头状瘤病毒容易侵犯声带与室带，环后区出现乳头状瘤的几率较少。而环后区喉粘膜由于缺乏碳酸酐酶iii的成分，对咽喉反流(lpr)损伤更加敏感，较易出现环后红斑和肿胀。因此为了更全面探究咽喉不同病变的发病机制，以及治疗预后情况，不仅需要构建能稳定生长、状态良好、持续传代的永生化喉上皮细胞，为细胞生物学研究提供稳定的分子平台，还需要分区域探讨不同致病因素的作用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对上述现有技术的不足之处提供一种拥有体外无限增值或接近于无限增值能力、来源于人喉腔环后区的永生化细胞；同时，本发明还提供了所述永生化环后区细胞的构建方法。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种永生化人喉环后区细胞，所述永生化人喉环后区细胞是在人喉腔环后区来源细胞中导入bmi1基因构建而成，所述永生化人喉环后区细胞拥有体外无限增殖或接近于无限增殖的能力。
8.所述bmi1基因是多梳基因家族(一种关键的表观遗传调节因子)中的重要组成部分，参与干细胞的增殖、分化与衰老，在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞的维持中有着重要的作用。本技术发明人首次尝试将bmi1基因导入人喉环后区上皮原代细胞，从而构建永生化人喉环后区上皮细胞株，并经过试验研究发现，构建所得永生化人喉环后区细胞株能够减缓喉环后区上皮细胞衰老，保持细胞活性，为咽喉环后区良恶性疾病致病机制研究提供稳定可靠的细胞模型。本技术通过bmi1构建永生化人喉环后区细胞，可以避免导入外源性hpv e6/e7及sv40病毒癌基因而带来的不必要分子变化，为后期的生物学机制研究提供更加精准的细胞模型。
9.本技术所述永生化人喉环后区细胞命名为人永生化环后bmi1(the human immortalized posterior commissure bmi1，hpc-bmi1)细胞)。
10.本技术所述bmi1基因可直接从市场购买，包括但不限于购自genecopoeia公司，该质粒被命名为plvthm/bmi1，并含有绿色荧光蛋白(gfp)和嘌呤霉素抗性标记。
11.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的优选实施方式，通过将携带有bmi1基因的重组质粒转染进人喉腔环后区来源细胞中构建成永生化环后区细胞。
12.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的优选实施方式，将携带有bmi1基因的重组质粒转染进人喉腔环后区来源细胞的方法为慢病毒载体。
13.本发明所述永生化人喉环后区细胞(hpc-bmi1)传代培养方法为：当每个集落长满无空隙时可以传代，用移液枪吸除瓶内旧培养液，加入0.5ml含0.25％胰蛋白酶和0.02％edta(1：1)已预热的混合液，放置于37℃培养箱中消化5分钟，倒置显微镜观察，当发现胞质出现回缩、细胞间隙增大时，用1ml枪头轻轻地反复吹打底部细胞，此时可见细胞成片脱落，如细胞仍粘附底部，可继续放入37℃培养箱延长消化时间1-2分钟，加入1ml 10％dmem高糖完全培养基终止消化，使之脱落成为细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入kbm培养基重悬细胞铺板进行培养。
14.另外，本发明的另一目的在于提供一种如上所述永生化人喉环后区细胞的构建方
法，为实现此目的，本发明采取的技术方案为：一种永生化人喉环后区细胞的构建方法，所述方法包括如下步骤：
15.(1)两步酶消化法加组织研磨人喉环后区上皮细胞原代培养：取全喉标本中环后区粘膜组织，在无菌环境下放入培养皿中，冲洗表面血污及杂质后分离组织，放入含有分散酶的离心管中浸泡；浸泡24小时后将离心管中的所有组织和培养液转移至无菌离心管中，离心后弃去上清，加入预热胰酶消化，加入10％dmem高糖完全培养基终止消化后，用枪头反复吹打组织，形成单细胞悬液；将单细胞悬液倒入筛网过滤，收集滤液，并将筛网上剩余组织放入培养皿中，反复研磨后加入10％dmem高糖完全培养基混匀组织，用筛网进一步过滤后离心，并弃去上清，利用kbm培养基重悬细胞铺板进行培养至细胞长出，14天左右可消化传代；
16.(2)感受态细菌的制备和质粒转化：采用的bmi1质粒(plvthm/bmi1)含有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性标记，将感受态细菌冰上融化后与dna样品混匀装入ep管中，在冰中放置20～40分钟后放入40～45℃水浴锅中30～60秒，然后冰中放置1～2分钟，加入预热的soc培养基，混匀后震荡摇晃培养；在无菌操作台中用枪头混匀液体，细菌充分悬浮后取菌液滴入氨苄青霉素抗性的筛选琼脂糖平板上并涂布均匀，倒置细胞皿，放置于培养箱中过夜；
17.(3)质粒提取：挑选优良的单克隆菌落加入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，震荡摇匀至液体出现浑浊后停止，取浑浊后的液体加入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，振摇后过夜，次日，将lb培养液分装至离心管中，离心沉淀细菌，弃上清；每管加入含rna酶的buffer r3试剂重悬细菌，吹打溶解；每管加入buffer l7，盖好盖子颠倒离心管混匀后室温放置；每管加入buffer n3，迅速颠倒混匀，不要回旋，室温离心后，将上清液移入buffer eql平衡滤柱过滤，洗涤柱子后，弃去过滤液，加入洗脱缓冲液，过滤，收集滤液予ep管中，加入异丙醇混匀后离心，弃上清，加入te试剂重悬质粒，测质粒浓度；
18.(4)慢病毒包装bmi1病毒：在ep管(a管)中加入opti-mem培养基，再加入lipofectamine 3000试剂混合；在ep管(b管)中加入opti-mem培养基，然后加入plvthm/bmi1、pspax2和pmd2.g轻柔混匀，避免斡旋；将a管液体加入b管中，轻柔混匀后室温孵育；将混合液体逐滴沿培养壁加到293ft细胞培养皿中，轻柔混匀，放入细胞培养箱培养后取出细胞，吸去培养基，加入预热的dmem完全培养基；
19.(5)病毒收集和细胞感染：步骤(4)中加入预热的dmem完全培养基培养72h后收集病毒上清液，用细胞滤器过滤病毒液，过滤后的病毒液可直接感染原代喉上皮细胞，病毒液与kbm-2培养基加入细胞皿中，每次感染5h，更换为无病毒kbm-2培养基培养5小时，再感染，感染3次；
20.(6)流式细胞仪分选含bmi1基因的人喉环后区上皮细胞：通过流式细胞仪对细胞进行分选获得gfp阳性人喉环后区上皮细胞，即得所述永生化人喉环后区细胞。
21.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中依次用95％酒精和dpbs缓冲液冲洗全喉标本中环后区粘膜组织表面的血污及杂质；所述加入预热胰酶后离心管中液体和组织的体积比为2:1。
22.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法的优选实施方式，所述步骤(2)中感受态细菌与dna样品的混合比例为：每50μl与不超过10ng的dna样品混合。
23.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法的优选实施方式，所述步骤
(3)为挑选优良的单克隆菌落加入8ml含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37℃震荡摇匀8小时，看液体出现浑浊后停止，取50ul加入300ml的含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇过夜，次日，将lb培养液分装至50ml离心管中，4000g离心10分钟沉淀细菌，弃上清；每管加入4ml已加rna酶的buffer r3试剂重悬细菌，吹打溶解；每管加入4ml buffer l7，盖好盖子颠倒离心管混匀后室温放置5min；每管加入4ml buffer n3，迅速颠倒混匀，不要回旋，13000rpm室温离心10min，将上清液移入15ml buffer eql平衡滤柱慢慢过滤，加入10mlw8洗涤柱子2次，弃去过滤液，加入5ml洗脱缓冲液e4,过滤，收集滤液予15mlep管中，加入3.5ml异丙醇混匀，13000rpm 4℃离心30min，弃上清，加入100ulte试剂重悬质粒，测质粒浓度。
24.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法的优选实施方式，所述步骤(4)在进行转染前24h将为1.3
×
10
6-1.5
×
106个生长状态良好的293ft细胞接种到10cm的细胞培养皿中，加入提前预热含10％胎牛血清的dmem完全培养基进行培养至转染当天，当细胞密度达到50％汇合时，进行慢病毒包装。
25.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法的优选实施方式，所述步骤(4)慢病毒包装的方法为：在ep管(a管)中加入500ul opti-mem培养基，再加入17ul lipofectamine 3000试剂混合；在ep管(b管)中加入500ul opti-mem培养基，然后加入16μg plvthm/bmi1、12μg pspax2和6μg pmd2.g轻柔混匀，避免斡旋；将a管液体加入b管中，轻柔混匀后，在室温孵育30分钟；将混合液体逐滴沿培养壁加到293ft细胞培养皿中，轻柔混匀，放入细胞培养箱8小时候后，从培养箱中取出细胞，小心吸去培养基，加入预热的dmem完全培养基。
26.作为本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法的优选实施方式，所述步骤(5)中用0.45um细胞滤器过滤病毒液，过滤后的病毒液可直接感染原代人喉环后区上皮细胞，将体积比为1:1的病毒液与kbm-2培养基加入细胞皿中，每次感染5h，更换为无病毒kbm-2培养基培养5小时，再感染，感染3次。
27.本发明所述永生化人喉环后区细胞，通过将bmi1基因导入人喉环后区上皮原代细胞，从而构建永生化人喉环后区上皮细胞株，并经过试验研究发现，构建所得永生化人喉环后区细胞株能够减缓喉环后区上皮细胞衰老，保持细胞活性，为咽喉环后区良恶性疾病致病机制研究提供稳定可靠的细胞模型。本发明所述永生化人喉环后区细胞的构建方法，取材方便、可重复性强、便于操作。
附图说明
28.图1为plvthm/bmi1质粒结构模式图；
29.图2为plvthm/bmi1质粒测序结果图；
30.图3为人喉环后区上皮原代细胞与hpc-bmi1细胞衰老程度对比图；
31.图4为人喉环后区上皮原代细胞与hpc-bmi1细胞增殖能力对比图；
32.图5为人喉环后区上皮原代细胞与hpc-bmi1细胞细胞周期对比图；
33.图6为人喉环后区上皮原代细胞与hpc-bmi1成瘤作用对比图；
34.图7为pepsin对il1α、il1β、il6、il8和caspase1水平的影响图；
35.图8为pepsin对caspase1、il1β和il18水平的影响图；
36.图9为采用荧光定量检测pepsin对ros水平的影响图；
37.图10为采用流式细胞仪检测pepsin对ros水平的影响图；
38.图11为pepsin对txnip水平的影响图；
39.图12为tempol、dpi和apo对pepsin刺激后细胞内ros的影响图；
40.图13为为tempol、dpi和apo对pepsin刺激后线粒体ros的影响图；
41.图14为tempol、dpi和apo对pepsin刺激后促炎症因子的影响图；
42.图15为pepsin处理的hpc-bmi11细胞中caspase1、il1β和il18转录水平对比图；
43.图16为apo对nlrp3、txnip、cleaved-caspase1、cleaved-il1β、il18的影响对比图；
44.图17为mcc950对nlrp3、txnip、cleaved-caspase1、cleaved-il1β、il18的影响对比图；
45.图18为apo和mcc950对pepsin细胞毒性的影响对比图；
具体实施方式
46.为更好的说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
47.实施例1
48.本发明永生化人喉环后区细胞的一种实施例，本实施例所述永生化人喉环后区细胞采用以下方法构建而成：
49.(1)两步酶消化法加组织研磨喉上皮原代培养：
50.用无菌手术刀片切取全喉标本中室带、声门下粘膜组织，尽量往喉部深层取，0.5-1cm大小，立即放入装有装有配好组织储存液(dpbs缓冲液+三抗)的1.5ml离心管中，4℃低温保存，尽快运送实验室处理，不超过24小时为宜；在无菌超净工作台中将喉组织标本取出，放入6cm培养皿中，先把保存液用移液枪吸干，用95％酒精冲洗5秒，再用dpbs缓冲液洗两次，去掉表面血污及杂质，用眼科剪分离组织，放入1.5ml离心管，加入分散酶浸泡4℃过夜；
51.隔天将所有组织块和培养液转移至15ml无菌离心管中，1500rpm离心5分钟，将上清弃去，加入预热胰酶(2:1＝液体：组织)37℃消化5分钟，加入10％dmem高糖完全培养基终止消化后，用枪头反复吹打组织，形成单细胞悬液，将细胞悬液倒入100um筛网过滤，收集滤液；将剩余筛网上的组织放入培养皿中，用5ml注射器底端反复研磨，将组织进一步碾碎，加入10％dmem高糖完全培养基混匀组织，用100um筛网进一步过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清，利用kbm培养基重悬细胞铺板进行培养，用12孔板为宜，每孔加入液体0.5ml为宜，隔天换液，此时可增加培养基量，每孔1ml，一般2—3天可以见到有细胞长出，14天左右可消化传代；
52.(2)感受态细菌(e.coli dh5α)的制备和质粒转化
53.bmi1购自genecopoeia公司，该质粒被命名为plvthm/bmi1，并含有绿色荧光蛋白(gfp)和嘌呤霉素抗性标记；将感受态细菌冰上融化(避免反复冻融)后，每50μl与dna样品(建议≤10ng)混匀装入1.5ml ep管中，在冰中放置约30分钟后，放入42℃水浴锅45秒，然后冰中放置1-2分钟，加入1ml 37℃预热的soc培养基，混匀后在37℃震荡摇晃培养1小时；在
无菌操作台中用枪头混匀液体，细菌充分悬浮后取约20ul的菌液滴入氨苄青霉素抗性的筛选琼脂糖平板上，用玻璃管均匀使细菌涂布于表面，倒置细胞皿，放置于37℃培养箱中过夜；
54.(3)质粒提取
55.挑选优良的单克隆菌落加入8ml含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37℃震荡摇匀8小时，看液体出现浑浊后停止，取50ul加入300ml的含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇过夜，次日，将lb培养液分装至50ml离心管中，4000g离心10分钟沉淀细菌，弃上清；每管加入4ml已加rna酶的buffer r3试剂重悬细菌，吹打溶解；每管加入4ml buffer l7，盖好盖子颠倒离心管混匀后室温放置5min；每管加入4ml buffer n3，迅速颠倒混匀，不要回旋，13000rpm室温离心10min，将上清液移入15ml buffer eql平衡滤柱慢慢过滤，加入10mlw8洗涤柱子2次，弃去过滤液，加入5ml洗脱缓冲液e4，过滤，收集滤液予15mlep管中，加入3.5ml异丙醇混匀，13000rpm4℃离心30min，弃上清，加入100ulte试剂重悬质粒，测质粒浓度；
56.(4)慢病毒包装bmi1病毒
57.本实施例采用lipofectamine 3000脂质体法进行慢病毒包装；在进行转染前24h将为1.3
×
10
6-1.5
×
106个生长状态良好的293ft细胞接种到10cm的细胞培养皿中，加入提前预热含10％胎牛血清的dmem完全培养基进行培养至转染当天，当细胞密度达到约50％汇合时，可以进行病毒包装；按照lipofectamine 3000脂质体法步骤进行包装：在ep管(a管)中加入500ul opti-mem培养基，再加入17ul lipofectamine 3000试剂混合；在ep管(b管)中加入500ul opti-mem培养基，然后加入16μg plvthm/bmi1、12μg pspax2(慢病毒包装质粒)和6μg pmd2.g(慢病毒载体)轻柔混匀，避免斡旋；将a管液体加入b管中，轻柔混匀后，在室温孵育30分钟；将混合液体逐滴沿培养壁加到293ft细胞培养皿中，轻柔混匀，放入细胞培养箱8小时候后，从培养箱中取出细胞，小心吸去培养基，加入预热的dmem完全培养基；
58.(5)病毒收集和细胞感染
59.72h后收集病毒上清液，用0.45um细胞滤器过滤病毒液，过滤后的病毒液可直接感染原代喉上皮细胞，病毒液与kbm-2培养基(1:1)加入细胞皿中，每次感染5h，更换为无病毒kbm-2培养基培养5小时，再感染，一般感染3次；病毒液不能在4℃放置太久，最好不要超过24h；
60.(6)流式细胞仪分选gfp阳性细胞(含bmi1基因的喉上皮细胞)
61.由于慢病毒载体plvthm/bmi1同时带有荧光蛋白gfp和puromycin抗性标记，通过流式细胞仪对细胞进行分选(fluorescence activated cell sorter,facs)获得gfp阳性喉上皮细胞；本技术发明人将获取的细胞命名为人永生化环后bmi1(the human immortalized posterior commissure bmi1，hpc-bmi1)细胞)。
62.实施例2
63.过表达bmi1质粒的plvthm/bmi1的构建及表达鉴定
64.构建的bmi1质粒含有gfp荧光片段和嘌呤霉素片段。利用大肠杆菌进行扩增与提取，经过菌落pcr和dna测序琼脂糖凝胶电泳鉴定与pre-bmi1设计序列完全一致(参见附图1和附图2所示)。提示重组的质粒plvthm/bmi1构建成功。
65.实施例3
66.hsg-bmi1和hv-bmi1细胞效果验证试验
67.1、bmi1过表达对人喉环后区上皮细胞细胞衰老程度的影响
68.建立稳定过表达bmi1的人咽喉环环后区原代细胞后，本技术发明人通过β-半乳糖苷酶染色实验来检测细胞衰老情况，衰老细胞在β-半乳糖苷酶的催化下会生成深蓝色的产物。实验可见，随着传代次数增加，第4代环后上皮原代细胞深蓝色产物比第2代环后上皮原代细胞明显增多，证明随着传代次数的增加人喉环后区上皮原代细胞衰老细胞数量增多，转染bmi1后，可见蓝色产物显著减少，转染后的环后区细胞继续传代发现，衰老细胞增加不明显，证明转染bmi1基因能减缓人喉环后区上皮细胞衰老，保持细胞活性(参见附图3所示)。
69.2、bmi1过表达对人喉环后区上皮细胞细胞增殖能力的影响
70.为了研究bmi1过表达对咽喉环后区上皮原代细胞增殖能力的影响，本技术发明人通过edu流式检测第2、4代未转染bmi1基因的咽喉环后区上皮原代细胞以及第5、9代hpc-bmi1细胞增殖情况，结果提示，第2代咽喉环后区原代上皮细胞增殖荧光值(pe-a)是1541，第4代咽喉环后区上皮原代细胞pe-a值是668，提示随着传代次数增多，细胞增值显著下降，感染bmi1后第5代hpc-bmi1细胞pe-a值是2038，说明bmi1能促进咽喉环后区上皮细胞体外增长，第9代hpc-bmi1细胞与第5代相比增值能力未见明显差异(参见附图4所示)。
71.3、bmi1过表达对人喉环后区上皮细胞细胞周期的影响
72.为了进一步研究bmi1促进细胞增殖的可能机制，本技术发明人通过流式细胞周期检测试剂盒检测了第2、4代未转染bmi1基因的咽喉环后区上皮原代细胞以及第5、9代hpc-bmi1细胞的细胞周期分布。结果显示，随着传代次数的增加，第4代咽喉环后区上皮原代细胞较第2代细胞分裂前期(g1期)细胞比例有所增加，dna复制期(s期)细胞比例显著减少，分裂后期(g2期)细胞比例有所减少。转染bmi1基因进入咽喉环后区上皮原代细胞后，g1期细胞比例有所减少，s期细胞比例显著增加，g2期细胞比例有所增加。该结果提示bmi1可促进dna合成并且促进咽喉环后区上皮细胞周期从g1期向s期分化(参见附图5所示)。
73.4、bmi1过表达对人喉环后区上皮细胞体内成瘤能力的影响
74.生长状态良好的咽喉环后区上皮原代细胞细胞、hpc-bmi1细胞、hep-2喉癌细胞(阳性对照)，分别随机接种于10只裸鼠左腋下(咽喉环后区上皮原代细胞)，左腹股沟(hpc-bmi1细胞)和右腹股沟(喉癌hep-2细胞)，接种细胞数为1
×
106，每组包括5只。接种第5天后，观察发现hep-2喉癌细胞注射的右腹股沟可见肿瘤形成。接种后第10天，右腹股沟区肿块明显增大，咽喉环后区上皮原代细胞以及hpc-bmi1细胞注射部位仍未见肿块形成。接种后第28天后，有个别裸鼠右腹股沟区肿块可见破溃现象，将裸鼠送去小动物mr成像仪拍照，显示两组小鼠仅有右腹股沟(喉癌hep-2细胞)有肿块生成，左腋下(咽喉环后区上皮原代细胞)和左腹股沟(hpc-bmi1细胞)未见肿块显影。将裸鼠处死，进一步解剖小鼠，两组小鼠仅有右腹股沟区有肿物形成，其他区域未见肿物，进一步剥离肿瘤拍照(参见附图6所示)。
75.通过本实施例的结果可知，本技术发明人通过转染多梳基因家族bmi1基因进入人喉环后区原代上皮细胞，建立喉环后区上皮永生化细胞，对其生物学特性进行观察研究,发现bmi1基因能抑制环后区上皮原代细胞衰老，促进细胞生长和增殖，并且构建的细胞能持续稳定传代但不会成瘤，为探讨咽喉环后区良恶性疾病机制研究提供稳定可靠的体外基础模型。
76.实施例4
77.采用本发明所述永生化人喉环后区细胞对咽喉反流致病机制的研究试验
78.咽喉反流(1aryngopharyngeal reflux lpr)与咽喉嗓音疾病密切相关，其中胃蛋白酶(pepsin)起重要作用。pepsin是lpr中主要的侵袭成分，能在咽喉部弱酸或非酸环境中损伤咽喉部粘膜，产生炎症，成为学界研究的热点。近年来pepsin的相关研究逐年递增，然而关于pepsin对咽喉部损伤机制研究仍缺乏，其具体炎性通路及机制尚不清楚。为了进一步阐明pepsin在炎性粘膜病变中的作用，本技术发明人通过在ph＝7环境下给予hsg-bmi1细胞和hv-bmi1细胞pepsin刺激，观察dna损伤、活性氧(ros)生成、线粒体损伤、炎症因子分泌在pepsin引起的咽喉部上皮细胞损伤机制中的作用，以研究慢性pepsin暴露咽喉部粘膜的相关分子效应。
79.1、pepsin对永生化人喉环后区细胞促炎细胞因子、nlrp3、ros和txnip表达水平的影响
80.为了研究pepsin对hpc-bmi1细胞的影响，本技术发明人使用qpcr检测pepsin刺激后几种促炎细胞因子(il1α、il1β、il2、il4、il5、il6、il8、il10、il18)的转录水平。结果显示il1α、il1β、il6和il8的转录水平显著升高(p＝0.005，p《0.001，p＝0.001，p《0.001)，其中il1β和il8的幅度最为明显，而il2、il4、il5、il10和il18与对照组相比无显著差异。与il1β一样，caspase1的转录水平显著增加(p《0.001)(参见附图7所示)。
81.随后，本技术发明人对caspase1、il1β和il18进行了蛋白质印迹检测。结果显示，cleaved-il1β和cleaved-casepase1的水平也显著升高，其中1mg/ml pepsin组更显著(参见附图8所示)。与对照组相比，cleaved-il18转录和蛋白表达水平无显著差异(p＝0.616)。荧光定量检测显示pepsin刺激后hpc-bmi1细胞中dhe的相对荧光强度显著增加，提示细胞内ros水平升高(p《0.01)(参见附图9所示)。流式细胞术结果显示线粒体pepsin刺激的细胞的ros显著增加(p《0.01)(参见附图10所示)。此外，1mg/ml pepsin组细胞内txnip水平显著高于对照组(参见附图11所示)。
82.2、三种ros抑制剂/清除剂对pepsin刺激的保护作用
83.本技术发明人发现，在hpc-bmi1细胞中，pepsin以剂量依赖性方式显著增加炎性细胞因子、nlrp3和ros的表达。为了进一步探讨它们之间的关系，本技术发明人首先分析了ros在炎症细胞因子释放中的作用。本技术发明人在pepsin刺激之前预培养nadph氧化酶抑制剂夹竹桃素(apo)/dpi和ros清除剂tempol，并观察对炎症细胞因子、细胞内和线粒体ros水平的影响。dhe荧光定量实验结果表明，预孵育apocynin、tempol和dpi组的dhe相对荧光强度显著低于单独pepsin组，其中apo组降低最为显著。f＝86.17，p《0.01)(参见附图12所示)。与ros抑制剂/扫描仪预孵育后，pepsin刺激诱导的线粒体ros增加显著减少，其中apo的作用最强(f＝53.97，p《0.01)(参见附图13所示)。与不同类型的ros抑制剂/清除剂预孵育也降低了pepsin升高的促炎细胞因子il1β(f＝6.827，p《0.01)和il8(f＝5.926，p《0.01)的转录水平(参见附图14所示)。因此，在随后的实验中选择apo作为ros抑制剂。
84.3.、ros和nlpr3在pepsin诱导的炎性损伤中的作用
85.为了进一步阐明pepsin诱导nlrp3炎症小体信号通路的机制，本技术发明人分析了在ros清除剂apo和nlrp3抑制剂mcc950存在下的nlrp3活性。本技术发明人首先进行了qpcr和蛋白质印迹，以研究apo和mcc950对txnip和nlrp3炎症小体和促炎细胞因子的转录
和蛋白质水平的影响。此外，还进行了ldh测试以探讨apo和mcc950对pepsin诱导的细胞毒性的影响。
86.1mg/ml pepsin处理的hpc-bmi11细胞中caspase1和il1β的转录水平显著高于对照组(f＝72.71，p《0.01；f＝117.66，p《0.01)。与1mg/ml组相比，apo和mcc950预孵育显著降低il1β和caspase1的转录水平。il18转录水平各组间无显著差异(f＝0.57，p＝0.65)(参见附图15所示)。
87.蛋白质印迹结果显示，与对照组相比，胃蛋白酶刺激的hpc-bmi1细胞的nlrp3、txnip、cleaved-caspase1和cleaved-il1β水平显著升高，pro-caspase1/pro-il1β水平显著降低。各组il18表达水平无显著差异。apo(参见附图16所示)和mcc950(参见附图17所示)可显著抑制nlrp3、txnip、cleaved-caspase1和cleaved-il1β的表达，各组间il18表达水平仍无显著差异。
88.ldh测定显示1mg/ml刺激组hv-bmi11细胞的细胞毒性为36.62
±
3.90。与刺激组相比，预孵育apo(27.83
±
5.74)和mcc950(29.23
±
5.43)有效降低pepsin细胞毒性(f＝39.97，p《0.01)(参见附图18所示)。
89.本发明所述hpc-bmi1细胞构建成功后，本技术发明人利用hpc-bmi1细胞对咽喉嗓音常见疾病咽喉反流(laryngopharyngeal reflux lpr)进行机制研究。本技术发明人通过在ph＝7环境下给予hpc-bmi1细胞lpr主要损伤因子pepsin刺激，观察nlrp3炎症小体、活性氧(ros)生成、线粒体损伤、促炎症细胞因子分泌，研究pepsin引起的咽喉部上皮细胞损伤作用机制及潜在相关分子效应。本技术发明人发现随着pepsin浓度的增高，hpc-bmi1细胞ros生成升高，nlrp3炎症小体表达增加，促炎性细胞因子(il1β和il8)表达上调，咽喉上皮细胞损伤增加，提出pepsin持续刺激喉上皮，导致大量ros的产生，这有助于txnip与trx结合以解离。随着复合物解离，txnip与nlrp3结合，导致nlrp3炎症小体激活。随后caspase-1的裂解导致pro-il-1β加工为其生物活性形式，然后促进其他炎症细胞因子的释放并招募大量炎症细胞，最终放大炎症级联反应，进而导致慢性咽喉炎症的持续进展。
90.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。