真核翻译起始因子4A1截短体及用途和检测方法

本发明属于生物医学领域，涉及一种诊断标记物，具体来说是天冬酰胺内肽酶靶向酶切eif4a1后产生eif4a1截短体及作为胶质瘤或胰腺癌诊断标志物的用途和检测方法。

背景技术：

1、目前胶质瘤的分子诊断标志物如idh1突变、mgmt启动子甲基化、染色体1p19q共缺失、tert启动子突变、egfr扩增或egfrvⅲ重排和petn、tp53突变等极大地促进了胶质瘤的分子诊断的进步，也为胶质瘤的个体化诊疗提供了依据。然而现有公认的胶质母细胞瘤生物标志物的发现基本是在基因层面或者表观遗传层面，而作为生命活动主要执行者的蛋白质，在恶性肿瘤的发生发展及恶性生物学行为中无疑是十分重要的。但是目前仍缺乏比较有价值的蛋白质标志物来作为胶质瘤的诊断标志。

2、不仅如此，在高度恶性的胰腺癌中也非常缺乏有效的筛查诊断标志物。胰腺癌的生物标志物集中于基因层面，胰腺癌的生物发生与抑癌基因kras、tp53、smad4、cdkn2a等基因突变有关。尽管在免疫靶点的发现上有诸多进展，但在蛋白标志物上的发现较为缺乏。

3、此外，在天冬酰胺内肽酶(aep)小分子抑制剂运用过程中，对于高级别胶质瘤，乳腺癌等肿瘤中具有一定的杀伤抑制作用，但还缺少一个比较可靠的肿瘤标志物来指导天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂的用药。因此，需要解决两个问题，其一，寻找用于评估高级别胶质瘤或胰腺癌恶性程度的生物标志物；其二，根据该肿瘤标志物的检测结果指导天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂的使用。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了真核翻译起始因子4a1截短体及用途和检测方法，所述的真核翻译起始因子4a1截短体及用途和检测方法要解决现有技术中尚缺乏比较有价值的蛋白质标志物来评估胶质瘤或胰腺癌的技术问题。

2、本发明提供了真核翻译起始因子4a1截短体，其氨基酸序列如seq id no.13所示。

3、本发明提供了上述的真核翻译起始因子4a1(eif4a1)截短体在制备用于诊断胶质瘤或胰腺癌的标志物中的用途。

4、本发明还提供了上述的真核翻译起始因子4a1截短体与天冬酰胺内肽酶联合在制备用于胶质瘤或胰腺癌诊断标志物中的用途。

5、本发明还提供了检测上述的真核翻译起始因子4a1截短体的试剂在制备用于诊断胶质瘤或胰腺癌的试剂盒中的用途。

6、本发明还提供了检测上述的真核翻译起始因子4a1截短体与天冬酰胺内肽酶的试剂在制备用于诊断胶质瘤或胰腺癌的诊断标志物试剂盒中的用途。

7、本发明还提供了一种检测上述的真核翻译起始因子4a1截短体的方法，包括如下步骤：

8、1)蛋白样品准备：细胞或组织蛋白抽提后加入电泳上样缓冲液，金属浴100℃煮10分钟；

9、2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：用微量加样器将蛋白样品及蛋白分子量标准加入孔中，正确连接电泳槽，设置电泳为80v,待蛋白样品前沿进入分离胶后，将电压调为120v，直到样品前沿迁移至凝胶底部，关闭电泳仪；

10、3)转膜：提前备好1x转膜缓冲液，并预冷处理，裁剪好pvdf膜，取出pvdf膜放入甲醇中浸泡14～16秒，活化pvdf膜；蛋白电泳转膜装置的夹板正确顺序依次摆放；在冰浴中用250ma恒流转膜2小时；

11、4)封闭：先将已经转膜好的pvdf膜移至含有洗涤缓冲液溶液的器皿中，然后再浸入质量百分比浓度为5％的脱脂牛奶中，在室温下封闭1小时；

12、5)一抗孵育：将所需要的一抗anti-flag(sigma-aldrich，cat.f1804)、anti-eif4a1(thermofish，cat.pa5-30216)、anti-aep(r&d systems，cat.af2199)、anti-β-actin(abway，cat.ab0011)按照抗体说明书上的比例要求，稀释在洗涤缓冲液溶液配制的质量百分比浓度为5％的脱脂牛奶中，放在摇床上4℃孵育过夜；次日，取出已孵育好一抗的pvdf膜，需用洗涤缓冲液溶液洗，每隔10分钟换一次洗涤缓冲液溶液,共3次；

13、6)二抗孵育：根据不同的种属一抗，选择辣根过氧化氢酶标记过的抗鼠/兔/羊二抗；将所需要的二抗按说明书上的稀释比例用洗涤缓冲液溶液配制的质量百分比浓度为5％的脱脂牛奶稀释，然后把清洗后的pvdf膜放置在二抗中孵育，密封后放在在摇床上或电动转子上孵育2小时；取出pvdf膜，继续用洗涤缓冲液溶液洗15分钟，每5分钟换一次洗涤缓冲液溶液；

14、7)显影：将化学发光显影剂试剂盒中a、b液按照1:1的比例配好制成发光工作液，所需剂量要根据膜面积大小而定，在使用前需要避光；曝光前先用平头镊将pvdf膜从洗涤缓冲液溶液中取出，用滤纸将膜背面水分略微吸干后放到压片盒内，正面向上；表面滴加发光工作液，在显影仪内进行显影。

15、8)结果解读：观察eif4a1特异性免疫印迹的pvdf膜，若出现大小为30kda的eif4a1切割带，即为天冬酰胺内肽酶靶向酶切eif4a1的产物真核翻译起始因子4a1截短体。

16、本发明提供了eif4a1(真核翻译起始因子4a1)的特异性切割带的检测手段，筛选了天冬酰胺内肽酶靶向切割eif4a1的肽链位点。本发明的诊断标志物是由天冬酰胺内肽酶(aep)特异切割eif4a1的n139位点产生的截短体t-eif4a1；本发明通过点突变的方法准确筛选到了aep对eif4a1的酶切位点为n139，产物eif4a1(v140-i406)的序列为140vraevqklqmeaphiivgtpgrvfdmlnrrylspkyikmfvldeademlsrgfkdqiydifqklnsntqvvllsatmpsdvlevtkkfmrdpirilvkkeeltlegirqfyinvereewkldtlcdlyetltitqavifintrrkvdwltekmhardftvsamhgdmdqkerdvimrefrsgssrvlittdllargidvqqvslvinydlptnrenyihrigrggrfgrkgvainmvteedkrtlrdietfyntsieemplnvadli406(seq id no.13)；并分别在胶质瘤细胞株a172、u87-mg和胰腺癌细胞株panc-1中进行了验证；其中，胶质瘤细胞系a172、u87-mg相较于人脑星形胶质细胞株heb，在胶质瘤细胞系中存在显著的eif4a1切割带；aep高表达的胰腺癌细胞系panc-1相较于对照组，亦存在较强的eif4a1切割带。因此，eif4a1截短体单独或联合aep可以用做胶质瘤和胰腺癌的诊断使用指标之一。

技术特征：

1.真核翻译起始因子4a1截短体，其氨基酸序列如seq id no.13所示。

2.权利要求1所述的真核翻译起始因子4a1截短体在制备用于胶质瘤或胰腺癌诊断标志物中的用途。

3.权利要求1所述的真核翻译起始因子4a1截短体与天冬酰胺内肽酶联合在制备用于胶质瘤或胰腺癌诊断标志物中的用途。

4.检测权利要求1所述的真核翻译起始因子4a1截短体的试剂在制备用于诊断胶质瘤或胰腺癌的诊断标志物试剂盒中的用途。

5.检测权利要求1所述的真核翻译起始因子4a1截短体与天冬酰胺内肽酶的试剂在制备用于诊断胶质瘤或胰腺癌的诊断标志物试剂盒中的用途。

6.一种检测权利要求1所述的真核翻译起始因子4a1截短体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了真核翻译起始因子4A1截短体，其氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。本发明还提供了上述截短体在制备用于胶质瘤或胰腺癌诊断标志物中的用途。本发明还提供了检测上述截短体的试剂在制备用于诊断胶质瘤或胰腺癌的诊断标志物试剂盒中的用途。本发明还公开了一种检测上述截短体的方法。本发明的诊断标志物是由天冬酰胺内肽酶切割eIF4A1产生的特异性截短体t‑eIF4A1；本发明还通过点突变的方法准确筛选到了该切割发生于N139位点；并在肿瘤细胞系中进行了验证，相较于正常细胞和对照组，在肿瘤细胞中高表达AEP时存在显著的t‑eIF4A1；本发明还通过放线菌酮法检测t‑eIF4A1在细胞内具有高度的稳定性；因此，t‑eIF4A1水平单独或与AEP联合可为胶质瘤或胰腺癌的诊断使用指标之一。

技术研发人员：林盈盈,张文蕊,师忠港,陈炳宏,王梦莹,廖克曼,高星
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15