一种利用路氏乳杆菌生产、测定丙酸钙的方法与流程

1.本技术涉及乳杆菌菌株的领域，更具体地说，它涉及一种利用路氏乳杆菌生产、测定丙酸钙的方法。


背景技术：

2.丙酸作为防腐剂和化学中间体，被广泛应用于食品、农业、制药工业等领域。目前丙酸的工业生产主要通过化学合成法。然而，化学合成法消耗的资源为不可再生资源，同时，该方法还容易造成环境污染，因此以可再生资源为原料的生物生产丙酸方式越来越受到人们的关注。另外，随着人民生活水平的提高，越来越多的消费者青睐生物基的食品防腐剂。作为使用量最大的食品防腐剂，生物基丙酸具有广阔的市场容量。
3.相关技术中，丙酸生物发酵工艺采用厌氧丙酸杆菌工艺，该过程不仅需要厌氧操作，对设备条件要求高，而且发酵周期长，产量低。因此，开发新一代的生物基丙酸合成工艺，大幅提升生产效率，增加产量是丙酸产业技术发展方向。
4.路氏乳杆菌(lactobacillus reutrei)常栖息于人和动物的肠道系统中，对人和动物无害，具有良好的生物相容性。美国fda已经认证路氏乳杆菌是一种安全和健康的可作为食品补充剂的益生菌，我国卫生部2003年正式批准路氏乳杆菌为可用于保健食品的益生菌菌种，更重要的是，该菌株的人体摄入安全性已由若干体外和动物临床研究所证实。除此之外，路氏乳杆菌本身是优良的肠道益生菌，可以部分替代抗生素用于饲料行业，提高养殖动物的免疫力，减少病害的损失。近年来，有实验发现路氏乳杆菌可以用于制备丙酸盐。然而，到目前为止，针对该研究尚未有相关报道，也并未出现以路氏乳杆菌为底物制备丙酸盐的产品。


技术实现要素：

5.为了开发新一代的生物基丙酸合成工艺，利用路氏乳杆菌成功制备丙酸盐，本技术提供一种利用路氏乳杆菌生产、测定丙酸钙的方法。
6.第一方面，本技术提供一种利用路氏乳杆菌生产丙酸钙的方法，采用如下的技术方案：一种利用路氏乳杆菌生产丙酸钙的方法，包括以下步骤：将失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌与1,2丙二醇混合，先后进行生长繁殖和富集培养；待富集培养结束后，将菌种置于含有钙离子的培养基进行发酵培养，制得丙酸钙。
7.通过采用上述技术方案，本技术中1,2-丙二醇作为底物，路氏乳杆菌作为催化剂。在路氏乳杆菌的催化下，1,2丙二醇脱水生成丙醛，由于路氏乳杆菌中的醇脱氢酶失活，抑制了丙醛生成1-醇脱氢酶的路径；另外，因此，路氏乳杆菌在发酵过程中，产生了辅酶a，在辅酶a的催化下，丙醛只能被催化生成丙酰辅酶a；同时，将菌种置于含有钙离子的培养基进行发酵培养时，促使丙酰辅酶a在酶促作用下脱出辅酶a，并在路氏乳杆菌的磷酸转乙酰基酶的催化下，快速转化成丙酰膦酸钙，丙酰膦酸钙在路氏乳杆菌中的丙酸激酶的作用下，迅速转化生成丙酸钙，通过检测得知，通过失活路氏乳杆菌中的醇脱氢酶，制得的丙酸钙的浓
度为9.75
±
0.15g/l。
8.本技术中，若未失活路氏乳杆菌中的醇脱氢酶，则丙醛容易在醇脱氢酶的作用下，大量生成1-丙醇，只有少部分参与形成丙酸钙，最终生成的丙酸钙的浓度仅为6.35g/l左右。因此，本技术失活路氏乳杆菌中的醇脱氢酶，构建了一种以1,2-丙二醇为底物，制备丙酸钙的途径，同时该途径下制得的丙酸钙的浓度比未失活前生成的丙酸钙的浓度高。
9.可选的，本技术通过基因编辑的方式失活路氏乳杆菌中的醇脱氢酶。
10.具体的，以1,2-丙二醇为底物，通过基因编辑失活路氏乳杆菌中的醇脱氢酶的操作途径如下：可选的，所述1,2丙二醇和失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌混合后，采用种子培养基对其进行生长繁殖，设置繁殖温度为37℃，时间为24h；所述种子培养基的配方为：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/l，葡萄糖24g/l，柠檬酸铵2.4g/l，醋酸钠6.2g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，硫酸锰0.16g/l，硫酸镁0.21g/l，吐温80 0.8g/l。
11.可选的，所述1,2丙二醇和失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌混合并生长繁殖后，采用液体培养基对其进行富集培养，设置富集培养的温度为37℃；所述液体培养基的配方为：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/l，1,2-丙二醇7.6g/l，柠檬酸铵2.4g/l，醋酸钠6.2g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，硫酸锰0.16g/l，硫酸镁0.21g/l，吐温80 0.8g/l。
12.可选的，所述菌种进行发酵培养的培养基为发酵培养基，设置培养温度为37℃，时间为24h；所述发酵培养基的配方为：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：酵母粉24g/l，1,2-丙二醇7.6g/l，柠檬酸铵2.4g/l，醋酸钠6.2g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，硫酸锰0.16g/l，硫酸镁0.21g/l，吐温80 0.8g/l。
13.通过采用上述技术方案，失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌在种子培养基的培养下，能够快速生长繁殖，扩增菌种的数量，当菌种在规定时间繁殖结束后，将繁殖后的菌种置于液体培养基中进行富集培养，使得菌种集中于某一区域，便于挑取；将挑取后的菌种置于发酵培养基中进行发酵培养，通过发酵培养，制得丙酸钙。
14.本技术中设置种子培养基、液体培养基和发酵培养基的配方的组分以及组分的具体用量，在实验中发现，只有控制组分的添加量，并且不同培养基的配方相互配合时，最终才能制得含量高的丙酸钙。
15.可选的，先对失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌通过常温等离子体诱变技术进行诱变，再将诱变后的失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌与1,2丙二醇混合。
16.通过采用上述技术方案，常压室温等离子体(artp)诱变技术是利用射频辉光放电原理，在常温常压状态下产生高能量的等离子体，等离子体中的活性粒子作用于路氏乳杆菌，使路氏乳杆菌中的细胞壁的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使路氏乳杆菌基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致路氏乳杆菌产生突变。与传统诱变方法相比，本技术采用的采用artp技术能够有效造成dna多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变菌株。
17.对失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌进行诱变处理，通过诱变后，再次进行接种培养，通过检测，诱变后的路氏乳杆菌产生的丙酸钙浓度更高，达到了将近27g/l，是诱变前的3倍左右。
18.可选的，在对失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌进行诱变之前，采用生理盐水对保存有失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌的保存液进行稀释。
19.可选的，在发酵培养基中加入25％氢氧化钙调节ph值至6-7。
20.可选的，在所述发酵培养基内加入碳酸钙。
21.通过采用上述技术方案，碳酸钙作为缓冲剂，维持发酵培养基中的ph值。
22.可选的，对发酵培养基内的诱变后的失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌进行筛选，并将筛选后的菌株重复多次进行富集培养和发酵培养。
23.通过采用上述技术方案，通过筛选获得遗传稳定性良好的突变菌株，并对其进行接种培养，得到生成丙酸钙的诱变后的路氏乳杆菌。
24.可选的，取发酵培养基上发酵培养后的发酵液，对发酵液进行离心，得到上清液；利用高效液相色谱法对上清液进行检测，测得丙酸钙含量。
25.通过采用上述技术方案，通过采用hplc测定路氏乳杆菌中丙酸钙的浓度。
26.第三方面，本技术提供一种利用路氏乳杆菌生产丙酸钙的方法在丙酸钙上的应用，采用如下的技术方案：一种利用路氏乳杆菌制备丙酸钙的方法，该方法能够制备丙酸钙。
27.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、丙醛在醇脱氢酶的作用下生成1-丙醇，申请通过失活路氏乳杆菌中的醇脱氢酶，从而抑制了该反应的进行，促使丙醛向生成丙酰辅酶a的方向进行，同时，也保证丙酰辅酶a朝着生成丙酰膦酸盐的方向进行，最终丙酰膦酸盐在失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌中的丙酸激酶的催化下，与发酵培养基中的钙离子结合，生成丙酸钙。
28.与传统产丙酸技术相比较，本技术中以1,2-丙二醇为底物、路氏乳杆菌为催化剂进行一系列反应，不仅发酵周期比传统产丙酸技术短2倍以上，而且整个过程不需要进行厌氧操作，是一种能够大规模应用于普通实验室的产丙酸钙的方法。
29.2、对基因编辑失活醇脱氢酶的路氏乳杆菌进行artp诱变，诱变后通过多轮筛选，得到稳定遗传的突变菌株，对菌株进行发酵优化，最终得到产丙酸浓度高的路氏乳杆菌，通
过高效液相色谱仪检测，得知，失活并诱变后的路氏乳杆菌产出的丙酸浓度是不进行失活、诱变的路氏乳杆菌产出的丙酸浓度的4倍左右。
具体实施方式
30.以下结合培养基配方和实施例对本技术作进一步详细说明。
31.培养基配方种子培养基(mmrs)：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/l，葡萄糖24g/l，柠檬酸铵2.4g/l，醋酸钠6.2g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，硫酸锰0.16g/l，硫酸镁0.21g/l，吐温80 0.8g/l，ph 6.3，37℃静置培养。
32.发酵培养基：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/l，1,2-丙二醇7.6g/l，柠檬酸铵2.4g/l，醋酸钠6.2g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，硫酸锰0.16g/l，硫酸镁0.21g/l，吐温80 0.8g/l，37℃培养，转速100rpm，用25％的氢氧化钙乳浊液调节ph到6.3。
33.液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/l，1,2-丙二醇7.6g/l，柠檬酸铵2.4g/l，醋酸钠6.2g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，硫酸锰0.16g/l，硫酸镁0.21g/l，吐温80 0.8g/l，37℃培养，转速100rpm，用25％的氢氧化钙乳浊液调节ph到6.3。实施例
34.实施例1借助基因编辑工具，对路氏乳杆菌中的醇脱氢酶基因进行单碱基突变，获得基因编辑后的菌株，对基因编辑后的菌株保存于甘油冻存管中；接着在甘油冻存管中加入1,2丙二醇，并混匀；待混匀之后，挑取基因编辑后的单菌落划线接种于mmrs固体平板上，在37℃下培养24h；接着在mmrs固体平板上挑取单菌落置于液体培养基中，在37℃下静置培养12h；按照2％接种量挑取液体培养基上的菌落并接种于发酵培养基中，在37℃静置培养24h；取1ml发酵液，在12000rpm下离心1min钟，得到的上清液即为待测样品。
35.采用高效液相色谱仪(hplc)对待测样品进行测定，设置hplc参数为：aminexhpx-87h有机酸柱，流动相为6mmol/l h2so4，流速为0.5ml/min，柱温55℃。检测得：基因编辑失活后醇脱氢酶基因的路氏乳杆菌可以生成浓度约9.75
±
0.15g/l丙酸钙。
36.实施例2借助基因编辑工具，对路氏乳杆菌中的醇脱氢酶基因进行单碱基突变，获得基因编辑后的菌株，对基因编辑后的菌株保存于甘油冻存管中；接着在甘油冻存管中加入1,2丙二醇，并混匀；待混匀之后，挑取基因编辑后的单菌落划线接种于mmrs固体平板上，在37℃下培养24h；接着在mmrs固体平板上挑取单菌落置于液体培养基中，在37℃下静置培养8h；取1ml菌液使用生理盐水稀释至107cfu/ml；按照artp诱变技术对菌液进行诱变处理；诱变后的样品再次使用生理盐水进行稀释，并涂布于含有5g/l碳酸钙的发酵培养基中，在37℃培养24h；根据发酵培养基中溶钙圈的大小进行初步筛选，将溶钙圈较大的菌落划线接种于mmrs固体平板上，在37℃下培养24h；
挑取培养后的单菌落接种于发酵培养基中，37℃静置培养8h；采用hplc检测突变株的丙酸钙浓度，设置hplc参数为：aminexhpx-87h有机酸柱，流动相为6mmol/l h2so4，流速为0.5ml/min，柱温55℃。
37.接着筛选出丙酸钙浓度最高的菌株，对其进行重复5轮artp技术诱变和筛选，得到一株产丙酸钙浓度最高的菌株。
38.采用发酵罐高密度发酵工艺对产丙酸钙浓度最高的菌株进行优化，将优化后的菌株接种于划线于mmrs固体平板上，在37℃培养24h；挑取mmrs固体平板上的单菌落接种于液体培养基中，在37℃静置培养12h；按照2％接种量集中于发酵培养基中，37℃静置培养24h；取1ml发酵液，在12000rpm下离心1min，离心得到的上清液即为待测样品。
39.采用hplc对待测样品进行测定，设置hplc参数为：aminexhpx-87h有机酸柱，流动相为6mmol/l h2so4，流速为0.5ml/min，柱温55℃。检测得：经过基因编辑和诱变后的路氏乳杆菌可以生成27.6
±
0.35g/l丙酸钙。
40.对比例1将野生型路氏乳杆菌保存于甘油冻存管中，在甘油冻存管中加入1,2丙二醇，并混匀；待混匀之后，从甘油冻存管中蘸取菌液划线于mmrs固体平板上，37℃培养24h；挑取mmrs固体平板上的单菌落接种于液体培养基中，在37℃静置培养12h；按照2％接种量接种于发酵培养基中，在37℃静置培养24h；取1ml发酵液，在12000rpm下离心1min，上清液即为待测样品。
41.采用hplc对待测样品进行测定，设置hplc参数为：aminexhpx-87h有机酸柱，流动相为6mmol/l h2so4，流速为0.5ml/min，柱温55℃。检测得：野生型路氏乳杆菌可以生成6.35
±
0.25g/l丙酸钙。
42.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。