一种抑制烟草马铃薯Y病毒活性菌株的筛选方法与流程

本发明涉及烟草病毒病防治，特别涉及一种抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法。

背景技术：

1、马铃薯y病毒是植物病毒最大属马铃薯y病毒属的典型代表，可在烟草的各个生长期进行系统性侵染，使烟株呈现花叶斑驳、畸形、叶脉坏死等症状，侵染时间越早，造成的危害程度越大。目前化学药剂防治被人们认为是最快速最简便的病虫害防治方式，但在烟草病毒病防治方面的直接控制能力有限，往往只在烟株抗病前期有一定的辅助作用，并不能完全阻止马铃薯y病毒在烟田生产上的爆发出现。因此分离筛选出对马铃薯y病毒病菌具有良好抑制作用和防治效果好的经济、环保型拮抗菌群是实施生物防治的前提与基础。

2、微生物在农业病虫害防治方面的巨大潜力和优点，大量筛选试验获得了具有对植物病害有较强防效的生防菌。例如，筛选自植物根际的生防菌不仅能对植株产生促生作用、增强植株的抗逆性外，还能对植物的土传病害病原菌产生抑制作用、修复土壤、改善植物根际微生态环境。但是目前，平板稀释法式微生物菌株筛选的常用方法，需要经过多次培养，划线纯化和功能验证等步骤，整个筛选过程周期长且操作繁琐。随着高通量测序技术的进步和测序成本的降低，人们对微生物生态多样性和功能多样性的了解更为便捷，这也极大的推动了微生物资源的挖掘与利用。

3、因此，本申请设计了一种抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其目的是为了解决现有拮抗功能菌株筛选技术的缺陷和不足。

2、为了达到上述目的，本发明提供一种抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，该方法基于微生物抑制病毒活性的效果来定向筛选，可以大大提高筛选效率，适用于烟草病毒拮抗菌的分离培养。

3、本发明的实施例提供了一种抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，包括如下步骤：

4、(1)拟定烟草植株为抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的原始生活环境，根据马铃薯y病毒病发病程度构建差异梯度，收集相应烟草植株茎部组织用于内生微生物总dna的提取和菌株分离，提取样品dna后，对微生物群落进行高通量测序，生成下游分析所需的数据；

5、(2)利用微生物群落中优势菌株的相对丰度和马铃薯y病毒病发病程度进行相关性分析，判断优势菌株是否为潜在的拮抗菌株，获得潜在的拮抗菌株，结合所述拮抗菌株的物种信息和生理生化特征，设计相应的选择培养基，筛选目标菌株，即抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株。

6、优选的，步骤(1)中马铃薯y病毒病发病程度梯度主要依据病症特征分为三个梯度，包括健康植株，轻度发病植株和严重发病植株。

7、优选的，所述步骤s1中所需数据通过对下机数据进行拼接、质控、过滤、去除嵌合体后，进行聚类和物种注释所获得。

8、优选的，步骤(2)所述拮抗菌株需要同时满足两个条件，所述步骤s1中所需数据通过对下机数据进行拼接、质控、过滤、去除嵌合体后，进行聚类和物种注释所获得。

9、优选的，步骤(2)分离出的目标菌株通过测序验证其与高通量测序确定拮抗菌株的一致性。

10、优选的，还包括将单一马铃薯y病毒病叶片的研磨液设为对照组，以所述目标菌株的发酵液与研磨液混合处理后的试剂为实验组，分别接种到烟草健康株的叶片上，重复三次，感染一周后调查统计烟株发病率。

11、基于一个发明总的构思，本发明还提供了上述方法在筛选烟草病毒病拮抗菌株中的应用。

12、本发明的上述方案有如下的有益效果：

13、本发明提供了一种抑制马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，该方法以烟草茎部组织为样品来源，从中筛选出来的拮抗菌株对环境的适应性更强，其拮抗效果也更加稳定。其次，该方法基于高通量测序结果，目标更加明确，筛选到拮抗功能菌株的成功率更高。

14、本发明对于未来拮抗菌株的筛选和绿色农业的发展具有重要意义，在筛选拮抗菌株中的应用前景广泛。

技术特征：

1.一种抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤s1中马铃薯y病毒病发病程度梯度主要依据病症特征分为三个梯度，包括健康植株，轻度发病植株和严重发病植株。

3.根据权利要求1所述的抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤s1中所需数据通过对下机数据进行拼接、质控、过滤、去除嵌合体后，进行聚类和物种注释所获得。

4.根据权利要求1所述的抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤s2中拮抗菌株需要同时满足两个条件，一个是所述拮抗菌株在所述微生物群落中是优势菌株，另一个是所述拮抗菌株相对丰度变化与马铃薯y病毒病发病程度显著负相关。

5.根据权利要求1所述的抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤s2分离出的目标菌株通过测序后进行序列比对验证其与高通量测序确定拮抗菌株的一致性。

6.根据权利要求1所述的抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法，其特征在于：还包括将单一马铃薯y病毒病叶片的研磨液设为对照组，以所述目标菌株的发酵液与研磨液等体积混合40min后的试剂为实验组，分别接种到烟草健康株的叶片上，重复三次，感染一周后调查统计烟株发病率。

7.根据权利要求1～6任一项所述的抑制烟草马铃薯y病毒活性菌株的筛选方法在筛选烟草病毒病拮抗菌株中的应用。

技术总结
本发明提供了一种抑制烟草马铃薯Y病毒活性菌株的筛选方法，以烟草茎部组织为样品来源，从中筛选出来的拮抗菌株对环境的适应性更强，其拮抗效果也更加稳定。其次，该方法基于高通量测序结果，目标更加明确，筛选到拮抗功能菌株的成功率更高。因此本发明对于未来拮抗菌株的筛选和绿色农业的发展具有重要意义，在筛选拮抗菌株中的应用前景广泛。

技术研发人员：黄松青,曹明锋,孔午圆,邓勇,张方旭,张小明,祝利,孙敬钊,朱益,张志华,陈明,艾季翔,贺非,王可
受保护的技术使用者：湖南省烟草公司常德市公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13