一种蛋白质微小晶体冷冻样品的制备及结构解析的方法与流程

本发明属于结构生物学领域，具体涉及一种冷冻电镜解析蛋白质微小晶体结构的方法。

背景技术：

以x射线衍射技术为核心的蛋白质晶体结构解析对于阐释蛋白质的生理及病理功能至关重要。常规晶体学研究的晶体尺度在几十到几百微米/维。但很多重要蛋白，例如神经退行性疾病中的致病淀粉样蛋白、膜蛋白等，由于自身柔性、非均一性等诸多因素的影响只能形成几十纳米到几微米的超微晶，利用常规x射线衍射技术无法解析该类微小晶体原子分辨率结构，故发明对该类晶体可行的冷冻电镜电子衍射方法，以解析该类微小晶体的原子分辨率结构。但微晶电子衍射技术是一种新颖的技术，还没有一种成熟的针对蛋白质的微小晶体的样品的制备及结构解析的方法。

综上所述，本领域迫切需要开发一种蛋白质晶体的样品制备及结构解析的方法；特别是针对微小晶体的样品制备及结构解析的方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种蛋白质晶体的样品制备及结构解析的方法；特别是针对微小晶体的样品制备及结构解析的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种蛋白质微小晶体结构的解析方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)对蛋白质微小晶体样品进行处理，得到上样液，所述的上样液为含分散的蛋白质晶体的溶液；

(2)冷冻样品的制备：对所述的上样液进行冷冻处理，得到冷冻样品；

(3)晶体筛选：通过电镜寻找用于解析结构的晶体，并确定晶体位置以及电镜的解析条件；

(4)数据收集：收集晶体不同角度的衍射图像；

(5)结构解析：根据不同角度的衍射图像，解析获得蛋白质晶体的结构。

在另一优选例中，解析的蛋白质晶体的结构的优选地，

在另一优选例中，解析的蛋白质微小晶体(厚度需要小于200nm，长与宽尽量大一些)的结构的优选地，

在另一优选例中，所述的蛋白质微小晶体为厚度≤200nm的晶体。

在另一优选例中，所述的解析条件包括：选区光阑的大小(优选为10μm)、光照的强度(优选为)。

在另一优选例中，所述的解析条件还包括：将单晶移到选区光阑的位置，并调整样品台高度，使得在样品台旋转过程中晶体不会移出选区光阑。

在另一优选例中，步骤(2)中，还包括步骤：

(2.1)提供一载网；

(2.2)向所述的载网表面加上样液(优选为2-5μl)；

(2.3)除去液体，使蛋白质晶体沉降于所述的载网上；

(2.4)对所述的载网及表面的蛋白质晶体进行快速冷冻，得到冷冻样品。

在另一优选例中，所述的冷冻样品中，所述的蛋白质晶体厚度为≤200nm。

在另一优选例中，步骤(2.3)中，还包括

(2.3.1)从载网背面吸取液体，使得载网正面留下含蛋白质晶体的粘稠状液体；

(2.3.2)用2-10％peg溶液洗涤所述的载网，并从载网背面吸除所述的peg溶液；

(2.3.3)用仪器吸除剩余液体，从而在载网正面留下蛋白质晶体。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述的载网是经过亲水化处理的载网。

在另一优选例中，，步骤(2.1)中，所述的载网选自下组：铜网、金网、镍网、或铜铑合金网；优选地，所述的载网为铜网。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述的载网的规格为r2/2。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述的载网为400目铜网。

在另一优选例中，步骤(2.2)中，向所述载网加入1～8μl的样品；优选地，向所述载网加入2～5μl的样品。

在另一优选例中，在所述的步骤(2.3)之后，重复进行步骤(2.2)，直至载网上留有足够的蛋白质晶体。

在另一优选例中，步骤(2.4)中，通过将载网插入液态乙烷中进行冷冻，得到冷冻样品。

在另一优选例中，所述的步骤(2.3.2)中，所述的peg溶液为1-20wt％的peg溶液，优选为1-10％(w/t)(例如5％)的peg溶液。

在另一优选例中，所述的步骤(2.3.2)中，所述的peg溶液为peg200溶液。

在另一优选例中，步骤(1)中，对于微小晶体蛋白质，所述的处理还包括下述步骤：

(1.1a)将晶体核捣碎以使晶体均匀分散在液滴中，得到晶体在池液中的分散体；

(1.2a)将晶体连同池液共同转移至离心管。

在另一优选例中，步骤(1.1a)中，通过针状工具进行捣碎。

在另一优选例中，所述的处理还包括步骤：

(1.3a)对所述的分散体进行稀释(根据晶体大小、分散性等因素进行稀释，以便得到可观测的样品)。

在另一优选例中，步骤(1)中，对于较大晶体(微米级别或者几百微米)蛋白质，所述的处理还包括下述步骤：

(1.1b)将移液器枪头剪去，将蛋白质晶体样品以及结晶溶液转移至ep管内；

(1.2b)对所述的蛋白质晶体样品溶液进行超声处理和/或震荡处理；

(1.3b)沉淀大晶体，取上部液体作为所述上样液。

在另一优选例中，步骤(1.2b)中，所述的超声处理为水浴超声。

在另一优选例中，步骤(1.2b)中，所述的超声处理的超声功率为10％～20％。

在另一优选例中，步骤(1.2b)中，所述的超声处理的时间为0.1～1s；优选地，为0.4～0.8s。

在另一优选例中，步骤(1.2b)中，所述的震荡处理为涡旋震荡。

在另一优选例中，步骤(1.2b)中，所述的震荡处理进行2～3次。

在另一优选例中，步骤(1.3b)中，通过旋甩沉淀大晶体。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的电镜为装有选区光阑的120kv的冷冻电镜。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述电镜的光照强度为优选地，为

在另一优选例中，步骤(4)中，所述的衍射图像收集包括：控制样品台匀速旋转，并控制相机同步曝光，然后进行衍射图像收集。

在另一优选例中，步骤(4)中，样品台匀速倾转与相机曝光同步。

在另一优选例中，所述的数据收集采用装有feg灯丝的feitecnai200kv电镜进行。

在另一优选例中，所述的数据收集采用装有lab6的120kv电镜进行。

在另一优选例中，所述的衍射图像收集还包括：

测定相机反应时间以及样品台反应时间；

设定起始旋转角度和终止角度，以及样品台旋转速度步长和相应的曝光时间；

调节铜网高度，使冷冻样品在样品台倾转过程中始终处在选区轴上；

倾转样品台到起始角度，开始数据收集。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.利用本发明方法解析的rac1多肽sysgys的结构(分辨率)

图2.利用本发明方法解析的常规蛋白lysozyme多肽sysgys的结构(分辨率)。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，开发了一种成熟的冷冻电镜用蛋白质晶体的冷冻样品的制备方法以及根据电镜获得数据解析这一蛋白质晶体结构的解析方法。本发明根据蛋白质纳米级微小晶体的自身特点，开发出了一整套晶体筛选，电镜样品制备，数据收集以及结构解析的方法。并首次利用120kv电镜解析出接近1埃的超高分辨率蛋白质结构。

样品处理方法

淀粉样蛋白聚集核心多肽所形成的微小晶体大多为针状晶体，并且很多呈海胆状，大量针状晶体聚集成团，较难处理得到分散的单根晶体。由于团簇状晶体在光学显微镜下可见，因此首先用针状工具将中间的核捣碎，使针状晶体能够均匀分散在液滴中，然后将晶体连同池液一同吸到离心管中，并进行适当稀释，得到晶体的混悬液，用于冷冻样品制备。

对于比较大的晶体，则需要进行超声或者涡旋震荡处理。将适量样品以及结晶溶液转移到合适大小的ep管内。水浴超声：在调至最低功率的水浴超声器内超声，时间控制在1s内，尽量不破坏晶包的完整性。涡旋震荡：涡旋时间为5s，若微晶聚集厉害，则需多次涡旋。

冷冻样品制备

根据晶体的浓度确定上样量，一般为4μl体积,样品制备为手动以及vitrobot联用。先将适量样品加载到亲水化处理后的冷冻铜网上，一般使用quantifoil公司型号为2/2，400目铜网，上完样后立即在另一侧用滤纸吸去液体，使晶体沉降在铜网上。若晶体浓度低，可多次上样，并于铜网反面吸干。由于晶体在生长过程中需要使用沉淀剂，因此溶液为粘稠状，导致溶液在vitrobot中不能被完全吸干，从而在铜网上产生较厚的冰层，电子不能穿透，得不到好的衍射图或者衍射质量很差，因此样品制备过程需要尽量将溶液移除。基于此我们发明了在吸去液体后用4μl5％peg200溶液进行洗涤，然后再从铜网背面吸去，达到了去除样品本身粘稠溶液以及为晶体防冻的双重效果。最后再利用vitrobot设置吸水时间30s，吸水次数2次，吸水压力1，将剩余溶液全部吸干。铜网迅速插入液态乙烷中快速冷冻，并在液氮环境中保存。

晶体筛选

制样完成后，使用装备有选区光阑的120kv的冷冻电镜进行微晶电子衍射筛选。利用冷冻电镜lowdose模式下进行。其中search选项调至lm图像模式，放大倍数为100×左右，用于确定晶体存在的区域。focus选项调为diffraction模式，相机长度比exposure大一个步长。该focus选项用于确定晶体的位置大小以及选区光阑的放置。exposure选项调为diffraction模式，在该选项下进行合轴并调节光强以及照明区域，调节选项为spotsize以及intensity,最终使光照强度为然后将光利用focus旋钮汇聚到一小点，同时确定选区光阑以及beamstop在光轴中间。exposure选项下调节完成后在search以及focus选项下不能再调节intensity等与光强有关的参数。

电镜调节完成后在search选项下选择有光阑的区域，切换到focus选项，具体选择需要衍射的晶体，并加载合适大小的选区光阑，放置beamstop，切换到exposure选项，直接曝光，曝光时间跟随样品衍射强度设定。

数据收集

微晶电子衍射数据收集利用软件进行。控制样品台匀速倾转以及相机同步曝光，先测定出相机反应时间以及样品台反应时间，再设定起始旋转角度和终止角度，以及样品台旋转速度步长和相应的曝光时间。设定完成后先调节铜网高度，使待衍射晶体在样品台倾转过程中始终处在选区轴上，然后倾转样品台到起始角度，加载选区光阑以及beamstop，设置文件存储名以及存储地址，开始数据收集。

结构解析

收集得到的数据文件为.mrc格式，首先根据测定的相机长度转换成.img格式文件。该格式文件可以直接利用x射线晶体学软件xds进行dataprocessing,integrate以及scale，得到缺失相位信息的密度.mtz文件。再使用phenix软件，做molecularreplace得到相位信息，并进一步refine，最终解析出微小晶体的结构。

本发明的主要优点包括：

本发明提供了一种厚度小于200nm的微小晶体的结构解析方法，填补了领域空白。通过本发明的方法解析的蛋白质结构分辨率高，对于较大的晶体达到了的分辨率，而对于蛋白质微小晶体更是到达了以下的分辨率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

多肽sysgys的结构解析

1)样品处理

首先用针状工具将中间的核捣碎，使针状晶体能够均匀分散在液滴中，然后将晶体连同池液一同吸到离心管中，并进行适当稀释，得到晶体的混悬液，用于冷冻样品制备。

2)冷冻样品制备

根据晶体的浓度确定上样量，体积为4μl，样品制备为手动以及vitrobot联用。先将适量样品加载到亲水化处理后的冷冻铜网上，一般使用quantifoil公司型号为2/2，400目铜网，上完样后立即在另一侧用滤纸吸去液体，使晶体沉降在铜网上。若晶体浓度低，可多次上样，并于铜网反面吸干。在吸去液体后用4μl5％peg200溶液进行洗涤，然后再从铜网背面吸去，达到了去除样品本身粘稠溶液以及为晶体防冻的双重效果。最后再利用vitrobot设置吸水时间30s，吸水次数2次，吸水压力1，将剩余溶液全部吸干。铜网迅速插入液态乙烷中快速冷冻，并在液氮环境中保存。

3)晶体筛选

制样完成后，使用装备有选区光阑的120kv的冷冻电镜进行微晶电子衍射筛选。利用冷冻电镜lowdose模式下进行。其中search选项调至lm图像模式，放大倍数为100×左右，用于确定晶体存在的区域。focus选项调为diffraction模式，相机长度比exposure大一个步长。该focus选项用于确定晶体的位置大小以及选区光阑的放置。exposure选项调为diffraction模式，在该选项下进行合轴并调节光强以及照明区域，调节选项为spotsize以及intensity，最终使光照强度为然后将光利用focus旋钮汇聚到一小点，同时确定选区光阑以及beamstop在光轴中间。exposure选项下调节完成后在search以及focus选项下不能再调节intensity等与光强有关的参数。

电镜调节完成后在search选项下选择有光阑的区域，切换到focus选项，具体选择需要衍射的晶体，并加载合适大小的选区光阑，放置beamstop，切换到exposure选项，直接曝光，曝光时间跟随样品衍射强度设定。

4)数据收集

微晶电子衍射数据收集利用软件进行。控制样品台匀速倾转以及相机同步曝光，先测定出相机反应时间以及样品台反应时间，再设定起始旋转角度和终止角度，以及样品台旋转速度步长和相应的曝光时间。设定完成后先调节铜网高度，使待衍射晶体在样品台倾转过程中始终处在选区轴上，然后倾转样品台到起始角度，加载选区光阑以及beamstop，设置文件存储名以及存储地址，开始数据收集。

5)结构解析

收集得到的数据文件为.mrc格式，首先根据测定的相机长度转换成.img格式文件。该格式文件可以直接利用x射线晶体学软件xds进行dataprocessing,integrate以及scale，得到缺失相位信息的密度.mtz文件。再使用phenix软件，做molecularreplace得到相位信息，并进一步refine，最终解析出多肽sysgys的结构。

解析结果如图1所示，解析出的sysgys多肽结构的分辨率达

实施例2

溶菌酶常规晶体的结构的解析。

1)样品处理

将适量样品以及结晶溶液转移到合适大小的ep管内。水浴超声：在调至最低功率的水浴超声器内超声，超声功率20％，水浴时间0.5s，尽量不破坏晶包的完整性。超声后样旋甩样品，使大块沉积在试管底部，轻取上部样品制样。

冷冻样品制备、晶体筛选、数据收集及结构解析步骤同实施例1。

解析结果如图2所示，析出的溶菌酶常规晶体的结构的分辨率为

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。