基因治疗用病毒载体相关的DNA残留质控策略

病毒载体生产过程中，可以通过评估HCD的残留来对非特异性核酸酶的使用进行优化，主要包括以下步骤：

1）分析检测未处理的过程中间品中HCD残留量和HCD片段大小分布；

2）根据非特异性核酸酶的酶活计算所需酶量；Benzonase可参照以下公式：

X（u/ml）=DNA浓度（ug/ml）/37

3）设定梯度酶浓度（如0.5×，1×，2×，3×等），作用时间（如1、2、4、8、12、24小时等），作用温度（20，25，37℃）及测试规模；

4）收集不同工艺点核酸酶处理后的样品，检测HCD残留和HCD片段大小分布。

图1 | 不同酶量、不同孵育时间核酸酶处理后，HCD残留量和HCD大小分布情况

基因治疗用病毒载体实际生产过程中，需要规模化的GMP级质粒用于转染步骤，过程还涉及质粒制备（图2）。因此，除了工艺引入的非特异性核酸酶中存在的宿主DNA残留外，还需严格控制质粒E.coli宿主细胞残留DNA、RNA和残留蛋白。

图2 | 源自参考文献[2]

基因治疗用病毒载体生产流程

需要特别注意的是，FDA提醒使用HEK293T细胞生产病毒载体时因存在SV40 T抗原，还需要检测残留的腺病毒E1（E1A & E1B）和SV40 T抗原序列。《中国药典》有关生物制品宿主残留核酸质量控制要求和CDE颁布的《细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点》中关于质粒和病毒载体的质量标准也提到，如使用HEK293细胞进行病毒载体生产，需进行宿主DNA和RNA残留、SV40大T抗原DNA残留、E1A和E1B基因DNA残留检测。

图3 | 源自参考文献[1]

六种 HEK293 细胞系的谱系关系示意图

图4| 源自参考文献[1]

通过 RNA 测序确定的 HEK293 细胞谱系中稳定整合的病毒基因（EBNA-1、SV40大 T、E1A 和 E1B）的 RNA 表达水平（以 DESeq2 比率中位数表示）和标准偏差（n=3）

划重点

►非特异性核酸酶广泛应用于病毒载体生产中的核酸残留消解；

►对病毒载体生产过程中相关DNA需要全面检测分析，包括病毒载体包装生产所用的细胞系HCD，特定细胞系所携带的风险基因，以及HCD的片段分布；

►高品质全面的HCD及风险基因DNA检测试剂盒使得核酸酶处理工艺的优化保证了稳定的残留核酸清除和高质量的病毒载体。

参考文献

[1] Magdalena Malm.Evolution from adherent to suspension:systems biology of HEK293 cell line development [J].Scientifc Reports,(2020) 10:18996

[2] Jane F. Barlow.Insights on Successful Gene Therapy Manufacturing and Commercialization[EB/OL].网页链接