样本收集手册 | 血清、血浆、尿液的收集方法及注意事项
各位老师、同学，新的一学期，让我们一起定个好好学习的“小目标”。从本周开始，我们将给大家陆续推出代谢组学、蛋白组学和多组学样本收集方法系列推文。样本收集在代谢组学实验中可谓是重中之重。良好的样本收集方法可以更真实的展现样本的代谢状态。话不多说，我们直接上干货。本次我们将首先推出临床样本中使用最多的血清、血浆、尿液这三种最为常见样本的收集方法以及注意事项。Here we go！！！
首先是血清、血浆样本的收集方法。代谢组学中我们一般情况下不会使用全血来进行检测，通常情况下会使用血清、血浆样本来进行组学实验。
P.S.：
我们也有收到全血样本的，在此提醒大家请务必在样本收集阶段就将全血样本做血清或者血浆分离，切忌将全血样本用干冰寄送过来，因为在前处理环节，样本解冻时会全部溶血，此类样本不建议再进行代谢组学实验了。
1.血清（Serum）
- 样品量要求：
GC-MS，LC-MS 实验 每个平台各200 µL/sample。
NMR 实验 500 µL/sample。
如果做多平台，为避免反复冻融，务必分装寄送。
- 样本收集步骤：
血液收集在离心管中37 ℃（或室温）静置1 h进行凝固分层。然后3000 rpm室温离心10 min，取上清转至干净的离心管中。再12000 rpm、4 ℃离心10 min，取上清分装到1.5 mL 离心管中，每管0.2 mL，-80 ℃冻存。足量干冰寄送。
- 注意事项：
1）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样。
2）取血时如用麻醉剂，建议用异氟醚，防止在NMR血清谱图中出现干扰峰。
3）血清参考产率：30%~50%（例如：1 mL全血大约能得0.3~0.5 mL血清）。
4）采全血时如使用真空采血管，请务必使用无预加抗凝剂的凝血管（帽盖为红色）。
5）强烈推荐尽量多地收集样本并分装冻存。
P.S.：
1.分装保存推荐使用1.5 mL离心管（这样可以用来做很多实验，且避免反复冻融）。不使用螺口冻存管是因为螺口冻存管管帽内有一个橡胶垫圈，但是长期在-80 ℃干冰低温下，橡胶圈会变硬脆，易脱落，导致密封不严，样本泄露。
2.如果有的实验室没有12000 rpm离心机，此步骤可以不做，寄送样本在信息单备注，实验员解冻后，离心进行后续实验即可。
2.血浆（Plasma）
- 样品量要求：
GC-MS，LC-MS 实验每个平台各200 µL/sample。
NMR 实验 500 µL/sample。
如果做多平台，为避免反复冻融，务必分装寄送。
- 样本收集步骤：
应使用肝素钠抗凝管（真空采血管帽盖为绿色）或EDTA抗凝管（真空采血管帽盖为紫色）采集全血，并尽快进行血浆分离：3000 rpm室温离心10 min（血样采集后室温放置需在1 h之内进行离心；血样采集后冰上放置需在2 h内进行离心），取上层，0.2 mL/管分装至1.5 mL离心管中。-80 ℃冻存。足量干冰寄送。
- 注意事项：
1）对于抗凝管的选择：代谢组学实验检测推荐使用肝素钠抗凝管（因为柠檬酸是TCA循环中的重要物质，使用柠檬酸钠抗凝剂的话会引入外源；而EDTA会影响NMR采谱；但肝素钠会抑制反转录酶活性从而对对RNA相关实验有负面作用，如果收集的样本用于RNA相关实验，则需要谨慎选择抗凝剂。)帽盖为黄色的凝胶分离管，其中的表面活性剂对于检测有影响，慎用。
2）最后分装保存推荐使用1.5 mL离心管，因为螺口冻存管管帽内有一个橡胶垫圈，但是长期在-80 ℃干冰低温下，橡胶圈会变硬脆，易脱落，导致密封不严，样本泄露。
3）血浆参考产率：≈50%（例如：1 mL全血大约能得0.5 mL血浆）。
- 备注：
1、采集到的血清、血浆样本颜色应该是淡黄色透明或者半透明液体，如果发现样本中是红色，说明在样本采集过程中出现了溶血现象。溶血后会导致样本的代谢谱发生很大的变化，所以出现溶血的样本建议重新制备。
2、确保样本收集过程的一致性，如血清样本要尽可能保证所有样品凝血时间的一致性。
3、样本分装后必须确保离心管盖紧且样本编号标记清晰，干冰寄送时请确保干冰量足且样本埋藏于干冰深处，泡沫箱密封严实且不易破损（建议在泡沫箱外面套层纸箱）。
收集方法参考文献：
[1]Yin P, Peter A, Franken H, et al. Preanalytical aspects and sample quality assessment in metabolomics studies of human blood[J]. Clinical chemistry, 2013: clinchem. 2012.199257.
[2]Dunn W B, Broadhurst D, Begley P, et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J]. Nature protocols, 2011, 6(7): 1060.
3.尿液
- 样本量要求：
500 μL/sample。
- 样本收集步骤：
1)预先配置叠氮化na工作液（0.5 mg/L，H2O），-20 ℃保存。
2)晨起中段尿（临床）或晨间1 h尿（动物）直接分装到离心管中，每管1 mL，并添加10 μL 叠氮化na工作液。
3)-80 ℃冻存寄送。
P.S.如若叠氮化na获取困难可用1000 rpm、4 ℃离心5 min，0.22 μm滤膜过滤方法代替。
- 注意事项：
1) 动物1 h尿量不够，可分多次收集，如果需要收取24 h尿液，请使用带有低温装置的代谢笼收取，并添加叠氮化na。
2) 叠氮化na的作用是防腐杀菌，有毒，请万分小心。
收集方法参考文献：
[1] Fernández-Peralbo M A, Castro L D. Preparation of urine samples prior to targeted or untargeted metabolomics mass-spectrometry analysis[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2012, 41(41):75-85.
[2] Bernini P, Bertini I, Luchinat C, et al. Standard operating procedures for pre-analytical handling of blood and urine for metabolomic studies and biobanks.[J]. Journal of Biomolecular Nmr, 2011, 49(3-4):231-243.
[3] Yuille M, Illig T, Hveem K, et al. Laboratory management of samples in biobanks: European consensus expert group report.[J]. Biopreservation & Biobanking, 2010, 8(1):65.
[4] Beckonert O, Keun H C, Ebbels T M, et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.[J]. Nature Protocols, 2007, 2(11):2692-2703.
最后附上我司协助客户以血清、血浆、尿液为样本发表的部分文章，供各位老师在发表文章的时候参考。
1. 中国农业大学：Xifan Wang, Songtao Yang, Shenghui Li, Liang Zhao, et al. Aberrant gut microbiota alters host metabolome and impacts renal failure in humans and rodents. Gut microbiota. 2020. IF=17.943
2. 浙江大学：Xue Ming-Yuan,Sun Hui-Zeng,Wu Xue-Hui et al. Multi-omics reveals that the rumen microbiome and its metabolome together with the host metabolome contribute to individualized dairy cow performance.Microbiome, 2020, 8: 64. IF=10.465
3. 香港中文大学：Xiang Zhang, Olabisi Oluwabukola Coker, Eagle SH Chu, et al. Dietary cholesterol drives fatty liver-associated liver cancer by modulating gut microbiota and metabolites. Gut 2020 Jul 21. IF=19.819
4. 深圳市绿航星际太空科技研究院：Feng Q, Lan X, Ji X, et al. Time series analysis of microbiome and metabolome at multiple body sites in steady long-term isolation confinement. Gut 2020 September 10. IF=19.819